慢性阻塞性肺疾病患者呼出氣冷凝液中白介素9水平變化分析

羅 嵐，陳 建，王廣發，胡 艷，宿 利

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種可以預防和治療的疾病，其特點表現為持續存在的氣流受限，氣流受限通常呈進行性發展，伴有肺部及氣道對有害氣體或有害顆粒所致慢性炎性反應的增加，急性加重和合并癥影響患者整體疾病的嚴重程度。呼出氣冷凝液(exhaled breath condensate，EBC)是檢測呼吸道疾病炎癥狀態的方法，是評價氣道炎癥和氧化應激程度的一種無創手段,具有簡便、易行、重復性好等優點，適用于病情嚴重患者和兒童，包括嬰兒在內[1]。白介素9(IL-9)是近年來受到關注的細胞因子。IL-9是由T細胞激酶誘導的T細胞及肥大細胞的生長因子，與不同種族的小鼠氣道高反應性相關，其基因定位于人染色體5q31-32，這個區域有與人變應性氣道炎癥相關的Th2細胞因子基因簇[2-7]，與哮喘的發病有密切聯系。但有研究表明，在COPD患者的肺組織及支氣管肺泡灌洗液(BALF)中也發現了IL-9[8-9]，國內研究顯示煙熏COPD大鼠模型組血清、BALF、肺組織中IL-9水平與正常對照組比較均顯著升高[10]，提示吸煙不僅導致支氣管肺局部表達IL-9增高，而且全身表達IL-9也增加。因此，IL-9可作為COPD氣道炎癥的檢測指標之一。本研究的目的是查看IL-9能否在EBC中被檢測出，同時探討IL-9在EBC中的水平能否反映吸煙及COPD患者氣道炎性水平。

1 資料與方法

1.1 病例納入和排除標準 入選標準：(1)COPD患者既往均有吸煙病史，累計吸煙量>10包年，穩定期和急性加重期患者符合2006版慢性阻塞性肺疾病全球倡議(GOLD)標準[11]。(2)健康吸煙組：累計吸煙量>10包年。(3)健康非吸煙組：完全不吸煙或累計吸煙量<0.2包年，且近3個月不吸煙。(4)至少6個月無吸入、口服及靜脈注射激素，急性加重期患者除外。(5)6個月內無口服茶堿、N-乙酰半胱氨酸、吸入長效β受體激動劑，急性加重期患者除外。排除標準：符合以下之一者排除，(1)兩周內有呼吸道炎癥者(鼻炎、咽炎、急性支氣管炎、肺炎)，急性加重期患者除外。(2)患有明確支氣管哮喘、肺間質纖維化、過敏性鼻炎、鼻竇炎、咽炎、扁桃體炎、消化性潰瘍、活動性肝炎、小血管炎、類風濕、系統性紅斑狼瘡、發作充血性心力衰竭、急性心肌梗死者。(3)近3個月居住地或工作環境裝修者。(4)不吸煙者3個月內有規律被動吸煙。(5)咳嗽、咳痰、氣短嚴重，不能耐受試驗者。(6)不能遵從研究方案者。(7)留取標本前1 h吸煙者。

1.2 臨床資料 選取2006年9—12月北京大學第一醫院診治的COPD穩定期患者20例為COPD穩定期組，其中男18例，女2例；年齡55～88歲；COPD病程2～40年；累計吸煙量10～74包年。同時期收入病房的COPD急性加重期患者9例為COPD急性加重期組，其中男6例，女3例；年齡53～82歲；COPD病程4～45年；累計吸煙量10～50包年。另選擇同時期在北京大學第一醫院體檢中心體檢的健康非吸煙人群14例為健康非吸煙組，其中男11例、女3例，年齡40～77歲；健康吸煙者10例為健康吸煙組，其中男8例、女2例，年齡43～67歲，累計吸煙量10～40包年。4組性別、年齡比較，COPD穩定期組與COPD急性加重期組COPD病程比較，健康吸煙組、COPD穩定期組與COPD急性加重期組累計吸煙量比較，差異均無統計學意義(P>0.05，見表1)。受試者均知情同意。

本研究創新點：

以往文獻的研究多針對于肺泡灌洗液、誘導痰、肺組織活檢等進行慢性阻塞性肺疾病(COPD)氣道炎性反應研究，如COPD患者支氣管黏膜下白介素9(IL-9)免疫反應的細胞數量增加,支氣管上皮中白介素9受體(IL-9R)、鈣激活氯離子通道(hCLCA1)的表達也顯著增加。在COPD患者的肺泡灌洗液中，氣道上皮細胞有IL-9的表達。而有研究表明，IL-9與肺泡巨噬細胞有著密切的關系，通過巨噬細胞直接參與COPD的發病過程，或通過與巨噬細胞膜表面的IL-9R結合參與炎性反應和氣道損傷。因此，本研究設想IL-9可作為COPD氣道炎癥的檢測指標之一，而呼出氣冷凝液(EBC)相對于肺泡灌洗液、肺組織活檢、誘導痰等檢查更加無創傷性、重復性高，是較好的檢測氣道炎癥的方法之一。檢測EBC中IL-9水平相關報道罕見，本研究旨在探討是否能通過EBC檢測到IL-9，且在COPD患者中其水平是否會有明顯升高，從而確定IL-9是否可作為通過EBC檢測COPD患者氣道炎性反應的手段之一。本研究證實了EBC中可以檢測到IL-9，但卻并未進一步證明其在COPD患者、健康吸煙者及健康非吸煙者之間的區別?？蛇M一步改進收集方法及檢測方法并擴大樣本量，以期待有更好的結果出現。

1.3 肺功能測定 受試者在收集EBC前使用Jaeger肺功能儀測定吸入支氣管擴張劑后第1秒用力呼氣末容積占預計值的百分比(FEV1%)和第1秒用力呼氣末容積/用力肺活量(FEV1/FVC)。

表1 4組一般資料比較Table 1 Comparison of general information among the four groups

注：COPD=慢性阻塞性肺疾病；*為χ2值，△為t值，余檢驗統計量值為F值；-為無此項

1.4 EBC收集 所有門診受試者在同一檢查室中留取標本，COPD急性加重期患者在病房留取標本。兩處室內溫度及濕度均保持恒定。EBC留取裝置參照文獻[12]自行設計，留取標本前需用蒸餾水漱口，戴鼻夾，坐位以平靜呼吸方式(呼吸頻率12～18次/min)通過浸在冰水混合物中的收集管呼出氣體，15 min，收集完畢后測量EBC的量，收集1～4 ml液體，并迅速分裝入4～5個EP管中編號，置入-70 ℃冰箱中存放。

1.5 IL-9水平測定 應用雙抗夾心酶聯免疫吸附法測定EBC中IL-9水平。試劑盒購自R&B公司。根據標準樣品測定出的吸光度(A)值繪制標準曲線,并采用曲線擬合法求出直線回歸方程；再根據各待測樣本的A值計算出相應標本的IL-9水平。

2 結果

2.1 4組FEV1%、FEV1/FVC、IL-9水平比較 4組FEV1%、FEV1/FVC比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；其中健康吸煙組、COPD穩定期組、COPD急性加重期組FEV1%較健康非吸煙組降低，COPD穩定期組、COPD急性加重期組較健康吸煙組降低，COPD急性加重期組較COPD穩定期組降低，差異均有統計學意義(P<0.05)；COPD穩定期組、COPD急性加重期組FEV1/FVC較健康非吸煙組和健康吸煙組降低，COPD急性加重期組較COPD穩定期組降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。4組IL-9水平比較，差異無統計學意義(P>0.05，見表2)。

表2 4組FEV1%、FEV1/FVC、IL-9水平比較Table 2 Comparison of FEV1%,FEV1/FVC and IL-9 among the four groups

注：FEV1%=第1秒用力呼氣末容積占預計值的百分比，FEV1/FVC=第1秒用力呼氣末容積/用力肺活量，IL-9=白介素9；與健康非吸煙組比較，*P<0.05；與健康吸煙組比較，△P<0.05;與COPD穩定期組比較，▲P<0.05

2.2 COPD患者IL-9水平與年齡、累計吸煙量、FEV1%、FEV1/FVC相關性分析 COPD穩定期患者IL-9水平與年齡、累計吸煙量、FEV1%、FEV1/FVC均無直線相關關系(r=0.119，P=0.372；r=0.880，P=0.382；r=0.210，P=0.825；r=-0.100，P=0.918，見圖1～4)。COPD急性加重期患者IL-9水平與年齡、累計吸煙量、FEV1%、FEV1/FVC均無直線相關關系(r=0.322，P=0.398；r=0.598，P=0.089；r=-0.480，P=0.902；r=-0.279，P=0.467，見圖5～8)。

3 討論

COPD由于其患病人數多、病死率高、社會經濟負擔重,已成為一個重要的公共衛生問題。現有的臨床技術如肺功能在診斷COPD中是以FEV1/FVC<70%作為標準，而這種診斷方式存在的問題是，常會在老年人中診斷較多的COPD，而在年齡小于45歲的人群中診斷不足[11]，可見很多COPD患者在出現氣流受限前氣道內的炎性反應早已經存在，因此早期監測氣道炎性反應，預測哪些人群可能進一步出現氣道結構改變，從而早期干預、延緩疾病進展，對于診斷治療COPD具有重大意義。目前監測手段有多種，但多為有創傷性操作，推廣范圍較窄。

注：IL-9=白介素9
圖1 COPD穩定期患者IL-9水平與年齡相關性分析散點圖
Figure1 Scatter plot of correlation between IL-9 level and age among stable COPD patients

圖2 COPD穩定期患者IL-9水平與累計吸煙量相關性分析散點圖Figure 2 Scatter plot of correlation between IL-9 level and accumulative cigarettes consumption among stable COPD patients

注：FEV1%=第1秒用力呼氣末容積占預計值的百分比
圖3 COPD穩定期患者IL-9水平與FEV1%相關性分析散點圖
Figure3 Scatter plot of correlation between IL-9 level and FEV1% among stable COPD patients

注：FEV1/FVC=第1秒用力呼氣末容積/用力肺活量
圖4 COPD穩定期患者IL-9水平與FEV1/FVC相關性分析散點圖
Figure4 Scatter plot of correlation between IL-9 level and FEV1/FVC among stable COPD patients

圖5 COPD急性加重期患者IL-9水平與年齡相關性分析散點圖Figure 5 Scatter plot of correlation between IL-9 level and age among acute COPD patients

圖6 COPD急性加重期患者IL-9水平與累計吸煙量相關性分析散點圖Figure 6 Scatter plot of correlation between IL-9 level and accumulative cigarettes consumption among acute COPD patients

圖7 COPD急性加重期患者IL-9水平與FEV1%相關性分析散點圖Figure 7 Scatter plot of correlation between IL-9 level and FEV1% among acute COPD patients

圖8 COPD急性加重期患者IL-9水平與FEV1/FVC相關性分析散點圖Figure 8 Scatter plot of correlation between IL-9 level and FEV1/FVC among acute COPD patients

EBC 檢測作為一種完全無創的檢測技術,對了解氣道炎癥,具有安全、可靠、簡便等特點,并能連續收集氣道EBC,反映肺部動力學變化,對動態監測氣道炎癥,評估藥物療效,無疑具有重要的實用價值。但EBC檢測仍處于科研階段,與BALF的對照研究較少,缺乏循證醫學的全面論證[13]。由于各個實驗室使用不同的收集方法和不同的檢測方法其檢測結果各異,原因可能有以下幾方面:(1)影響EBC收集的因素很多,目前尚無規范的收集方法,標準的收集方法至關重要。因為不同的物質保存需要不同的溫度,所以冷卻和儲存標本的溫度需要標準化。物質的黏附程度因收集容器的不同而不同,所以收集的容器也應標準化；(2)EBC中物質含量很低,檢測方法靈敏度低,導致檢測結果不穩定；(3)EBC中成分復雜,可檢測上千種物質,但這些物質之間很容易發生化學反應、降解和生成新物質。盡管有這些不足之處，但越來越多的研究證明EBC檢測在肺部疾病的診斷方面起著重要作用,具有廣闊的發展前景。目前，已有相當多的文獻報道COPD患者EBC中各種因子的水平，研究較多的因子有過氧化氫、pH值、類花生四烯酸類〔人白三烯4(LTB4)、大鼠白三烯(LTE4)、8-異前列腺素、前列腺素E2(PGE2)、前列腺素F2α(PGF2α)〕、一氧化氮(NO)相關物(S-亞硝基硫醇、亞硝酸鹽)、醛類物質(丙二醛、己醛、庚醛)、細胞因子(IL-6、IL-8、IL-1β、IL-10、IL-12、p70)。IL-9是新近再次被人們關注的細胞因子之一，以往其均在哮喘的發病中被提到，但新的研究表明，其可能參與了COPD的發病過程，因為參與COPD發病的兩種細胞(中性粒細胞及巨噬細胞)表面均有數量較多的IL-9受體(IL-9R)的表達，且國外有報道，COPD患者BALF中的IL-9水平是有所升高的[9]。EBC中可以含有的最大的蛋白質分子量應該小于65 KD，IL-9的分子量為40 KD，因此，推測IL-9在EBC中可以被檢出，且可能與COPD的嚴重程度相關。吸煙為COPD發病的重要危險因素，吸煙的患者EBC中與炎性反應氧化應激相關的因子會有所升高，因此本研究中也收集了一部分健康吸煙者的EBC，希望其中IL-9水平較其他幾組會有所差異。

本研究結果顯示，EBC中IL-9水平COPD穩定期組為(0.52±0.49)ng/L、COPD急性加重期組為(0.32±0.07)ng/L、健康吸煙組為(0.42±0.18)ng/L、健康非吸煙組為(0.43±0.20)ng/L，4組間無差異，同時COPD穩定期及急性加重期患者IL-9水平與年齡、累計吸煙量、FEV1%、FEV1/FVC均無直線相關關系?？紤]原因如下：EBC中IL-9水平總體較低，各組間差異有可能無法正常體現。肺內IL-9可以由巨噬細胞、支氣管上皮細胞分泌，有文獻報道誘導痰液IL-9水平可達(35.2±27.8)ng/L，誘導痰液可以良好地反映氣道的炎癥，炎性遞質產生并附著于氣道上皮，在氣道上皮中高表達的蛋白在誘導痰液中可以有較高的濃度[14]。EBC組成成分中包括氣道內襯液，氣道內襯液也能一定程度上反映氣道炎癥，但IL-9分子量較大，可能能夠進入EBC中并被攜帶出來的量要較那些分子量較小的蛋白少，影響了EBC中IL-9的水平。另樣本量較少，不能體現總體情況，也會影響結果。

本研究分析數據時發現3例吸煙者EBC中IL-9水平明顯升高，最高達2.10 ng/L，追問留取前吸煙情況，3例均在留取前30 min內吸煙，1例非吸煙者IL-9水平達3.88 ng/L，追問病史其在留取標本前20 min內有被動吸煙史。推測香煙可能會增加氣道上皮分泌IL-9的量，但這種影響可能是一過性的，在離開煙熏環境后一段時間內IL-9水平會有所下降。巨噬細胞是參與COPD發病的主要細胞之一，而IL-9R存在于肺泡巨噬細胞表面，發現IL-9可抑制巨噬細胞的氧化爆發反應，COPD患者IL-9水平與巨噬細胞呈正相關，免疫組化結果顯示IL-9主要在巨噬細胞胞質表達[14]。IL-9與巨噬細胞關系密切，香煙可刺激巨噬細胞分泌一系列的炎性因子導致進一步的炎性反應，目前尚無證據證明巨噬細胞可以分泌IL-9，但其分泌的其他炎性因子亦有可能刺激產生IL-9的細胞如上皮細胞，使吸煙者氣道中IL-9水平升高。

本研究還注意到，COPD急性加重期患者IL-9均數要相對較小，這與預期的結果相悖。考慮原因，本組患者均為住院接受治療的患者，患者1周內均用過抗生素，3例患者應用全身激素及吸入激素治療，IL-9水平分別為0.29、0.29、0.28 ng/L；3例患者只吸入激素治療，IL-9水平分別為0.32、0.38、0.33 ng/L。腎上腺糖皮質激素是目前臨床上廣泛應用的抗炎藥物，用于治療支氣管哮喘、肺纖維化及COPD等。腎上腺糖皮質激素作用的機制之一是通過抑制核因子(NF)-κB，減少細胞因子和炎性遞質的基因表達和分泌，是目前所知的最強的NF-κB抑制劑。抑制NF-κB的活化并進一步抑制氣道的炎性反應?？紤]應用激素治療可能對EBC中IL-9的水平有影響，推測COPD急性加重期患者IL-9水平較穩定期患者低，可能與應用激素有關。但因為樣本數太少，本研究不能作進一步分析。

由于目前關于EBC中IL-9的相關文獻報道較少，本研究結果顯示，IL-9在EBC中是可以被測出的，但由于影響EBC中炎性因子水平的因素較多，如吸煙、藥物等，盡管已經將末次吸煙時間定在1 h以上，但有些患者并不能正確反映真實吸煙情況，推測IL-9水平可能與末次吸煙時間存在相關性。藥物治療如激素也可能對其濃度有所影響。另外，改進檢測IL-9水平方法，增加檢測的靈敏度，亦可增加結果的陽性率。

EBC有著越來越廣闊的研究前景，今后的研究方向為規范操作技術,重點解決檢測方法的問題,尋找一種操作流程簡便、價格合理的檢測方法,以適于醫院和家庭監測疾病,不久的將來此方法將代替支氣管肺泡灌洗在臨床上廣泛應用,最終為呼吸系統疾病患者提供一種方便、小型、家用型氣道炎癥監測儀。

1 Kharitonov SA,Barnes PL.Biomarkers of some pulmonary diseases in exhaled breath[J].Biomarkers,2002,7(1):1-32.

2 Kelleher K,Bean K,Clark SC,et al.Human interleukin-9:genomic sequence,chromosomal lacation，and sequences essential for its expression in human T-cell leukemia virus(HTLV)-1-transformaed human T cells[J].Blood,1991,77(7):1436-1441.

3 Doull IJ,Lawrence S,Watso M,et al.Alletic association of gene markers on chromosomes 5q and 11q with atopy and bronchial hyperresponsiveness[J].Am J Respir Crit Care Med,1996,153(4 Pt 1):1280-1284.

4 Demolin JB,Renauld JC.Interleukin-9 and its receptor:an overview of structure and function[J].Int Rev Immunol,1998,16(3/4):354-364.

5 Van Snick J,Croethals A,Renauld JC,et al.Cloning and characterization of a cDNA for a new mouse T cell growth factor(P40) [J].J Exp Med,1989,169(1):363-368.

6 Schmitt E,van Brandwijk R,Van Snick J,et al.TCGFⅢ/P40 is produced by native murine CD4+T cell but is not a general T cell growth factor[J].Eur J Immunol,1989,19(11):2167-2170.

7 Hunltner L,Druec C,Moeller J,et al.Mast cell growth-enhancing activity(MEA) is structurally related and functionally indentical to the novel mouse T cell growth factor P40/TCGFⅢ[J].Eur J Immunol,1990,20(6):1413-1416.

8 Hauber HP,Bergeron C,Tsicopoulos A,et al.Increased expression of the calcium activated chloride channel in hCLCA1 in airways of patients with obstructive chronic bronchitis[J].Can Respir J,2005,12(3):143-146.

9 Vermeer PD,Harson R,Einwalter LA,et al.Interleukin-9 induces goblet cell hyperplasia during repair of human airway epithelia[J].Am J Respir Cell Mol Biol,2003,28(3):286-295.

10 楊雪梅，萬毅新.慢性阻塞性肺疾病大鼠肺內白細胞介素9和γ干擾素的表達[J].中國呼吸與危重監護雜志,2006,5(4):297-300.

11 GOLD Executive Committee.Global strategy for the diagnosis,management,and prevention of chronic obstructive pulmonary disease(Revised 2011)[R].2011.

12 喬華,王廣發,丁翠敏.呼出氣冷凝液收集器的設計及其臨床應用探討[J].臨床內科雜志,2005,22(9):625-626.

13 Freels JL,Robbins RA，Campbell SC.Exhaled breath condensate:the past,present and future[J].Clin Pulm Med,2003,10:263-268.

14 劉政,姚婉貞,陳燕,等.白細胞介素 9在慢性阻塞性肺病發病中的作用[J].北京大學學報:醫學版,2004,36(4):403-406.