蘋果ACO1基因及轉錄因子MdHB-1基因的表達模式

朱 敏，尹明安，葉紅紅，任小林

（西北農林科技大學園藝學院，陜西 楊凌 712100）

蘋果ACO1基因及轉錄因子MdHB-1基因的表達模式

朱 敏，尹明安*，葉紅紅，任小林

（西北農林科技大學園藝學院，陜西 楊凌 712100）

研究蘋果MdACO1基因及轉錄因子MdHB-1基因在不同器官和不同發育階段的表達量及其對外源乙烯的反應，以期探討兩基因之間的可能關系。以蘋果品種“皇家嘎拉”為試材，利用實時熒光定量聚合酶鏈式反應技術分析不同器官和果實不同發育階段基因的表達，以及乙烯利處理果實對基因表達的影響。在不同組織器官中，MdHB-1在花瓣中表達量較高，而MdACO1在成熟果中表達量較高。在果實不同發育階段中MdHB-1在未成熟果中（盛花期40 d后）表達量最高，MdACO1在成熟果中尤其是花后100 d表達量最高。外源乙烯利（500 mg/L）處理的果實放置0～1 d時抑制MdHB-1的表達，但在7 d后其表達量增高；MdACO1表達量在外源乙烯利處理后迅速升高，并隨著放置時間的延長而大幅度增高。轉錄因子MdHB-1可能參與了蘋果幼嫩果實和花器官中其他相關基因表達的調控，這一過程似與MdACO1無關。MdACO1參與了果實的成熟過程，但并無受MdHB-1調控的跡象。外源乙烯會誘導成熟果實ACO1基因的過量表達，這一反饋調節過程似與MdHB-1無關。

蘋果；ACO基因；轉錄因子MdHB-1；表達模式；乙烯

作為世界四大水果之一的蘋果（Malus pumila Mill.）是呼吸躍變型果實，其成熟衰老過程受內源乙烯的影響極大。如何從分子水平調控蘋果果實的乙烯合成，延緩果實成熟衰老，提高其耐貯性，是蘋果采后生理和采后分子生物學的一個重要研究方向。而“皇家嘎拉”作為一個品質好又不耐貯運的早熟品種，是人們常用的研究材料。

乙烯通常被稱為植物的成熟激素，在植物的種子休眠和萌發、器官的衰老和脫落、性別分化等方面起著重要的作用，同時它還參與植物逆境脅迫響應和細胞程序性死亡等過程[1-3]。在乙烯的生物合成途徑中，ACC氧化酶（ACC oxidase，ACO）是關鍵的限速酶之一，具有重要的調控作用[4-5]。ACO基因的表達與植物器官的成熟、果品保鮮等有密切的關系。因此，研究ACO基因的表達模式，揭示其表達調控途徑，有助于調控果實的成熟，闡明乙烯合成的分子機理。在高等植物中，ACO基因的表達受諸如發育、環境和激素信號等因素的調控，并且有時間、組織器官表達特異性[6-7]。已有研究表明，ACO基因的時空表達是受轉錄因子調控的結果。轉錄因子通過特異地與ACO基因啟動子的順式作用元件結合，調節基因的表達，間接地調節乙烯的合成，控制植物體內乙烯的水平[8]。Lin Zhefeng等[9]成功克隆到番茄ACO1的轉錄因子LeHB-1的基因，發現它是HD-Zip亞家族Ⅰ的成員，能與LeACO1啟動子結合；病毒誘導沉默LeHB-1的表達有效抑制了LeACO1 mRNA的積累，而且基因的異位過表達導致花器特征的改變以及萼片向果實類似結構的轉化。將擬南芥AtHB-1基因在煙草中過表達，發現其對葉片生長發育起到很重要的作用[10]。向日葵HaHB-4在轉錄水平上受水分狀況和ABA的調控，并且還是乙烯信號傳遞系統的新成員，過表達該基因的轉基因擬南芥植株衰老明顯延遲，對乙烯也不太敏感；該基因的表達可以明顯抑制合成乙烯相關基因如ACO的表達，同時還會抑制乙烯信號傳遞成員基因ERF2和ERF5的表達[11]。

在蘋果中，自第1個ACC氧化酶基因（MdACO1）被克隆到以來[12]，共發現了3 個ACO基因[13]，其中，MdACO1的表達只局限在果實組織中，尤其是在成熟的果實中大量表達，MdACO2則主要在幼嫩果實組織中表達，少量在幼嫩葉片中表達，而MdACO3則主要在幼嫩和成熟葉片中表達，在幼嫩和成熟果實組織中幾乎不表達[14]。于巧平等[15]從皇家嘎拉花器官同源克隆得到了一個全長基因MdHB-1，其編碼的蛋白含有高度保守的61 個氨基酸的HB結構域，屬于HD-Zip轉錄因子家族成員，同源性分析得知MdHB-1與LeHB-1的同源性極高，但MdHB-1是否調控MdACO1的表達還不得而知。

目前，有關MdHB-1和MdACO1之間的關系還未見研究報道。本研究以“皇家嘎拉”蘋果為實驗材料，通過研究MdACO1及轉錄因子MdHB-1在不同器官和不同發育階段的表達量，揭示其表達模式，同時研究這兩個基因對于外源乙烯的響應特點，以期探討兩基因之間的可能關系，為進一步揭示蘋果乙烯生物合成的調控機制以及蘋果果實成熟的分子機制提供有用信息。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為西北農林科技大學園藝學院園藝場蘋果（Malus pumila Mill.）“皇家嘎拉”品種，于2012年4月下旬取幼葉、成熟葉和花器，包括初花期的花蕾和盛花期的花（將花分為雌蕊、花藥、萼片和花瓣），并在之后采取不同時期的果實（盛花期后10、40、70、100、110、115、120 d），樣品在現場經液氮速凍后置于－70 ℃超低溫冰箱中保存以備提取RNA。

另外將采取的花后110 d果實在乙烯利（ethephon，ETH）質量濃度為500 mg/L，體積分數0.02%吐溫-20的水溶液中浸泡2 min。對照組：將同樣的樣品在含0.02%吐溫-20的水溶液中浸泡2 min。將處理過后的果實和對照組果實自然風干分別放置0、0.5、1、2、4、7、10、15、21 d。溫度20～25 ℃左右，每組做3 次重復，每次重復6 個果實。將上述處理的果實經液氮速凍后放于－70 ℃超低溫冰箱進行保存，為提取RNA做準備。

1.2 試劑與儀器

PrimeScript?RT reagent Kit反轉錄試劑盒、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ實時熒光定量試劑盒 大連寶生物工程公司；IQ5多重實時熒光定量PCR儀 美國Bio-Rad公司；其他常規化學試劑均為國產分析純。

1.3 方法

采用宋蓓等[16]的改良十六烷基三甲基溴化銨-氯化鋰（hexadecyltrimethyl ammonium bromide-lithium chloride，CTAB-LiCl）法提取“皇家嘎啦”蘋果各組織材料總RNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，核酸蛋白檢測儀測定A260nm/A280nm、A260nm/A230nm以確定RNA的純度和濃度。

MdHB-1的引物為：F1，5’-GGATTGATGGATC AGGAGAG-3’；R1，5’-GCACCTGGTCAGAA GTGAG-3’，MdACO1的引物為：F1，5’-GACTTGGACT GGGAAAG-3’；R1，5’-CTTCTCCAGTTCCACTGC-3’。蘋果內參基因actin的引物為：F1，5’-CATCCAGGCTGTTCT TTCCCTCT-3’；R1，5’-GCCACGCTCAGTC AAAATTTTCA-3’。擴增片段大小為140 bp。反應體系為20 μL，包括10 μL Master預混液，上下游引物各0.8 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O 7.4 μL。PCR反應程序為：95 ℃預變性5 min后，95 ℃ 10 s→56 ℃ 30 s（熒光檢測），35 個循環，后延伸56 ℃ 30 s，設置熔解曲線，以檢測引物是否可用。每個基因做3 次重復。反應所使用的儀器為IQ5多重實時熒光定量PCR儀。

數據分析根據Livak等[17]報道的2－ΔΔCt法進行。

2 結果與分析

2.1 MdHB-1和MdACO1在不同組織器官中的表達模式

圖1 “皇家嘎拉”蘋果不同組織中MdHB-1相對表達量Fig.1 Relative expression levels of MdHB-1 in different tissues of “Royal Gala” apple

由圖1可知，MdHB-1在“皇家嘎拉”蘋果在葉、花、幼果（盛花期后10 d）等組織中均有表達，表達量從高到低依次為：花瓣、雌蕊、幼葉、萼片、幼果、花藥、成熟葉、花蕾、成熟果（盛花期后100 d）。其中，花瓣表達量最高，為雌蕊的1.5 倍；成熟果表達量僅為花瓣的1/16。這表明MdHB-1在幼果組織和花器官中表達量較高，在成熟果實中的表達量較少。

圖2 “皇家嘎拉”蘋果不同組織中MddACO1相對表達量Fig.2 Relative expression levels of MdACO1 in different tissues of“Royal Gala” apple

由圖2可知，MdACO1在花、果實等組織中都有表達，表達量從高到低依次為：成熟果（盛花期后100 d）、花瓣、花藥、花蕾、幼果（盛花期后10 d）、萼片、雌蕊、幼葉。成熟果的表達量最高。其中，成熟果表達量為花瓣的10.1 倍；花瓣表達量為幼果的2.2 倍。這表明MdACO1在成熟果實中表達量較高，在幼果及花器官組織中表達量很低，在葉片中幾乎不表達。

從圖1和圖2的比較中可以看出，MdHB-1和MdACO1在各器官中的表達模式并不一致。

2.2 MdHB-1和MdACO1在蘋果果實不同發育階段的表達模式

由圖3可知，MdHB-1在盛花期后10 d開始慢慢升高，40 d左右表達量達到最高峰，隨后開始下降，從盛花期后70 d到120 d左右表達量依次下降，直到果實完全成熟后表達量降到最低，盛花期后40 d為120 d表達量的79.8 倍。這表明MdHB-1在果實生長發育過程中表達量逐漸減少，在幼果（盛花期后10、40、70 d）中表達量較高，不同成熟階段果實（盛花期后100、110、115、120 d）中表達量較低。

圖3 “皇家嘎拉”蘋果果實不同發育階段中MdHB-1相對表達量Fig.3 Relative expression levels of MdHB-1 in different development stages of “Royal Gala” apple

圖4 “皇家嘎拉”蘋果果實不同發育階段中MdAO1相對表達量Fig.4 Relative expression levels of MdACO1 in different development stages of “Royal Gala” apple

由圖4可知，MdACO1在盛花期后100 d時表達量達到最高值，前40 d左右表達量非常低，70 d后開始上升，盛花期后100 d為40 d的690.6 倍，110 d左右表達量驟然下降，115 d果實完全成熟后表達量有小幅度下降，120 d表達量又開始上升，是盛花期后40 d的98.4 倍。這表明MdACO1在幼果發育過程中表達量很少或幾乎沒有，成熟果中尤其是花期100 d表達量很高。

從圖3和圖4的比較中可以看出，MdHB-1在果實發育前期10～70 d相對表達量很高，在果實成熟及后期階段100～120 d其相對表達量驟然下降，而MdACO1在果實發育前期10～70 d相對表達量很低，在果實成熟后期100～120 d其相對表達量很高。二者表達模式并不一致。2.3 MdHB-1和MdACO1對外源乙烯處理后的表達特點

圖5 乙烯利處理后MdHB-1基因的相對表達量Fig.5 Relative expression level of MdHB-1 gene after ethylene treatment

由圖5可知，在“皇家嘎拉”蘋果花后110 d的果實中，在0～1 d內，經過乙烯利處理的果實MdHB-1的相對表達量顯著低于對照組，說明外源乙烯在0～1 d內抑制了MdHB-1的相對表達量。第2～4天內處理組MdHB-1的相對表達量和對照組基本持平，在7～21 d內，處理組果實MdHB-1的相對表達量高于對照組比并隨著時間的增長而增高，在處理21 d后其相對表達量達到最大值，是0 d的5.9 倍。

圖6 乙烯利處理后MdACO1基因的相對表達量Fig.6 Relative expression levels of MdACO1 gene after ethylene treatment

由圖6可知，經過乙烯利處理的果實MdACO1表達量迅速升高，顯著高于對照組的果實，并且MdACO1表達量隨著乙烯利處理后放置時間的增長而大幅度增高。21 d后的果實經過乙烯利處理和未經過處理的對照其MdACO1表達量都是最高，并分別是0 d表達量的280.3 倍和122.2 倍。

從圖5和圖6的比較中可以看出，MdHB-1和MdACO1對外源乙烯的反應表達模式并不一致。

3 討 論

轉錄因子（反式作用因子）是一種能同DNA啟動子順式作用元件特異性結合的蛋白質分子，其主要功能是激活或者抑制特定基因的轉錄[18]。轉錄因子在基因的表達調控中起重要作用[19]。同源異型盒蛋白就是一類重要的轉錄因子。該類型轉錄因子調控與生長發育有關的基因，具有一個高度保守的結構域是其最顯著的特征。同源異型-亮氨酸拉鏈（homeodomain-leueine zipper，HD-Zip）蛋白是植物中所發現的一類轉錄因子，包含一個高度保守的同源異型結構域（HD）[20]。HD-Zip轉錄因子的DNA同源結構域與DNA特異結合，Leu zipper（Zip）元件介導蛋白二聚體的形成，二聚體的形成對它們行使功能具有重要意義。轉錄因子與DNA分子的結合及其二聚化作用很容易受到一些小化學分子的影響，從而它們可以調節轉錄因子介導的基因表達調控[21-23]。Lin Zhefeng等[9]發現的LeHB-1是模式植物番茄中ACO1的轉錄因子，其為HD-Zip亞家族Ⅰ的成員。于巧平等[15]發現的蘋果轉錄因子MdHB-1也為HD-Zip家族成員，且在MdACO1啟動子部位有其相應的可能結合的順式作用原件序列。

本研究發現，“皇家嘎拉”蘋果中轉錄因子MdHB-1在雌蕊、花藥、花瓣、萼片、未成熟果實中的表達量較高，在果實發育過程中其表達量呈現下降趨勢。Lin Zhefeng等[9]的研究發現，模式植物番茄的ACO1基因的轉錄因子LeHB-1在花芽、衰敗花、未成熟果實、綠熟果中表達量較高，但是其mRNA水平在成熟過程中呈現下降趨勢，并且在成熟果實中保持相對低的表達水平。LeHB-1在幼葉、成熟葉中也有表達，在花器官中表達量很高，尤其在萼片和雌蕊。本研究得到的結果與Lin Zhefeng等[9]的研究結果是基本一致的。

本研究進一步發現，“皇家嘎拉”蘋果中，MdACO1在花、果實等組織中都有表達，表達量最高的是成熟果，其次是是花瓣，在幼葉和成熟葉中幾乎不表達；在不同發育階段的果實中，MdACO1在幼果中表達量很少或幾乎沒有，而在成熟果中尤其是盛花期后100 d果實中表達量很高。Binnie等[14]的相關研究表明：MdACO1基因主要是在蘋果的成熟果中表達，而在幼果中其表達量很少，在蘋果葉子中幾乎檢測不到其有表達。對比發現，蘋果MdACO1基因與番茄LeACO1、LeACO4，桃子PpACO1等基因的表達形式相似，再次證明了MdACO1是與果實成熟有關的基因。由于本實驗中MdACO1在幼葉和成熟葉中的表達量均幾乎為零，所以同樣可以推測該基因對蘋果功能葉的作用非常小。

Lin Zhefeng等[9]的研究發現，在番茄果實轉色期第7天，通過病毒誘導的基因沉默（virus induced gene silencing，VIGS）方法使LeHB-1基因沉默，LeHB-1基因64%～90%被沉默，會引起LeACO1表達量80%～86%的降低。他們認為轉錄因子LeHB-1不僅調控番茄ACO1的轉錄，也調控著番茄果實成熟。LeHB-1編碼一級HD-Zip蛋白質，并且與LeACO1的啟動子結合，LeHB-1基因的沉默使得LeACO1 mRNA水平也降低，從而抑制LeACO1的表達來延緩果實成熟。LeHB-1在綠熟期果中表達量比較高，破色期開始降低[9]，然而LeACO1 mRNA水平在綠熟期果中開始增加，并且在果實成熟過程中其積累量在逐漸升高[24]。

轉錄因子MdHB-1基因與MdACO1基因在各器官和不同發育階段果實中的表達模式（或者說表達譜）并不一致的事實說明，MdHB-1作為轉錄因子可能參與了蘋果幼嫩果實和花器官中其他相關基因表達的調控，但此過程似與MdACO1無關。MdACO1參了果實的成熟過程，但并無受MdHB-1調控的跡象。本實驗的研究結果與Lin Zhefeng等[9]的研究結果有些出入，其原因可能由于番茄是茄科茄屬植物，其果實為漿果，而蘋果是薔薇科蘋果屬植物，果實為仁果類，二者在分類學和組織學上均存在著很大的差異。

許多情況下，基因表達和mRNA豐度的變化是由激素和信息傳遞來調控的。Yang Xiaotang等[25]認為在蘋果果實中乙烯相關基因的表達變化與乙烯調控果實成熟變化是一致的，他們根據表達模式獲知，ACO基因與乙烯的生成緊密相關，ACO1是蘋果果實中乙烯生物合成的主要因素。在反義ACO1轉基因株系中，抑制ACO1可以使乙烯合成水平明顯降低[26]。本研究發現，乙烯利處理后0～1 d內MdHB-1的表達水平顯著低于對照組，說明外源乙烯在這段時間內抑制了其表達水平；7 d以后MdHB-1的表達水平才開始逐漸上升并隨著時間增長而相應提高。而MdACO1在乙烯利處理之后表達量迅速增加，且日益增高。MdHB-1和MdACO1對外源乙烯的反應并不一致。外源乙烯通過反饋調節系統促使MdACO1表達量增加，這一過程似與MdHB-1無關。

本實驗依據MdHB-1和MdACO1在基因表達上的時空相關性對該二者之間的關系進行了初步探討，由于研究方法的局限性和生命科學的復雜性，研究結果還有待于借助其他研究手段的進一步證實或修正。因為MdHB-1基本定性為轉錄因子，而在MdACO1啟動子部位有其相應的可能結合的順式作用原件序列，加之模式作物番茄的研究結果，二者之間可能的調控關系只有經過多方面的實驗研究才能最終否定或肯定。研究二者結合作用的研究方法有電泳遷移率檢測（electrophoretic mobility shift assay，EMSA）、酵母單雜交、染色質免疫沉淀技術等，研究二者是否有上下游調控關系的研究方法包括VIGS及反義RNA、RNAi、超表達等轉基因技術。

Zheng Qifa等[27]研究結果表明為了調控果實成熟和響應乙烯處理有一個動態的蛋白網絡機制來識別蛋白的顯著變化。除此之外，通過乙烯的處理可以誘導出在一些未經處理的成熟果實中未曾出現的一系列特定蛋白。他們發現這些特定蛋白的產生在蘋果果實成熟階段可以顯著影響抗氧化還原系統、乙烯的生物合成、防御機制、初級和次級代謝活動。所以今后進一步的研究應該包括有針對性地開發和應用定量蛋白質組學方法來研究負責果實成熟和衰老的目標蛋白。如本實驗中通過乙烯的處理可能誘導出現一些特定蛋白，這些特定蛋白的出現可能使MdACO1 mRNA表達量大幅度上升。

4 結 論

轉錄因子MdHB-1可能參與了蘋果幼嫩果實和花器官中其他相關基因表達的調控，這一過程似與MdACO1無關。MdACO1參了果實的成熟過程，但并無受MdHB-1調控的跡象。外源乙烯會誘導成熟果實ACO1基因的過量表達，這一反饋調節過程似與MdHB-1無關。該結論有待于其他研究手段的進一步證實或修正。

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Expression Patterns of ACO1 Gene and Transcription Factor MdHB-1 in Apple

ZHU Min, YIN Ming-an*, YE Hong-hong, REN Xiao-lin
(College of Horticulture, Northwest A&F University, Yangling 712100, China)

In this study, we investigated the expression patterns of the MdACO1 gene and its transcription factor MdHB-1 in different organs at different developmental stages in apple, as well as their response to exogenous ethylene treatment, with the purpose to reveal the relationship between these genes. The expression levels of MdACO1 and MdHB-1 in apple cultivar “Royal Gala” were detected in different organs at different fruit development stages, also under exogenous ethylene treatment by real-time quantitative PCR. Results showed that in different organs, MdHB-1 showed relatively higher expression level in petal, while MdACO1 exhibited relatively high expression level in mature flesh. At the different stages of fruit development, MdHB-1 gene was expressed highest in young flesh (about 40 days after the full flowering stage), but MdACO1 gene exhihibited the highest expression level in mature fruits, specifically at 100 days after the full flowering stage). Under exogenous ethylene treatment, the expression of MdHB-1 was inhibited in the fruits stored for 0-1 d, but its expression level increased after 7 d storage, while the expression level of MdACO1 gene increased rapidly with the extension of time. These results suggested that MdHB-1 may be involved in the regulation network of gene expression in young apple fruits and floral organs, while MdACO1 was not involved in these processes. The MdACO1 gene played an important role in the maturation of apple fruits, which was not regulated by MdHB-1. In addition, exogenous ethylene could induce the high expression of MdACO1 in “Royal Gala”, while MdHB-1 did not participate in this feedback regulation process.

apple; ACO gene; transcription factor MdHB-1; expression patterns; ethylene

S661.1

A

1002-6630（2014）23-0166-05

10.7506/spkx1002-6630-201423033

2014-01-08

國家現代農業（蘋果）產業技術體系建設專項（nycytx08-05-02）

朱敏（1989—），女，碩士研究生，研究方向為果蔬采后生理及分子生物學。E-mail：zhumin2008happy@163.com

*通信作者：尹明安（1956—），男，教授，博士，研究方向為果蔬采后生理及分子生物學。E-mail：yinma22@163.com