外泌體在疾病診療中的研究進展

劉艷華綜述,王小中審校

(南昌大學第二附屬醫院檢驗科,江西南昌330046)

.綜述.

外泌體在疾病診療中的研究進展

劉艷華綜述,王小中審校

(南昌大學第二附屬醫院檢驗科,江西南昌330046)

外泌體是多種細胞主動分泌的直徑為40~100 nm的囊泡,這些成分可以從多種體液中分離.外泌體含有蛋白質, mRNA,miRNAs等信號分子,它們反映分泌細胞的生理狀態和功能狀態,從而提供了豐富的潛在的生物標志物分子源.除了用于疾病診斷外,外泌體還具有抗腫瘤免疫,誘導腫瘤免疫逃逸、促進腫瘤血管新生和腫瘤轉移等生理功能.本文主要對外泌體在疾病診療中的研究進展進行綜述.

外泌體;生物標志物;MicroRNA;診斷;治療

外泌體(Exosomes)是一種細胞主動分泌的大小均一,直徑為40~100nm的脂質雙分子層結構囊泡,可由樹突細胞、淋巴細胞、血小板、肥大細胞、內皮細胞、成纖維細胞、間充質干細胞和腫瘤細胞等不同細胞類型脫落釋放,在大多數體液如外周血、尿液、唾液、腹水、羊水、乳汁、腦脊液、關節液、支氣管肺泡灌洗液等體液中可檢測到[1].透射電子顯微鏡下外泌體觀察常為杯狀,但是在體液中通常為球形結構,在蔗糖溶液中的密度為1.13~ 1.19g/ml,其密度與細胞來源相關,并隨蛋白含量而改變[2].不少實驗證明外泌體可攜帶多種蛋白質、脂質、mRNA、miRNA,參與細胞通訊、細胞遷移、血管新生、免疫反應和腫瘤細胞生長等過程.然而,外泌體的發現雖有30多年歷史,但其在疾病診療方面的研究還處在初級階段.

1 外泌體的起源、結構及其生物學特性

1985年Pan等[3]通過電鏡發現,在網織紅細胞向成熟紅細胞發育過程中,晚期胞內體可與細胞膜相融合釋放其中大量的亞細胞囊泡結構,由于外泌體含有大量特異性的蛋白質及功能性的mRNAs、miRNAs,是細胞積極分泌的結構,與凋亡細胞分泌的小泡有著本質區別.外泌體的質膜含有豐富的膽固醇、鞘磷脂、神經酰胺、脂筏及磷脂酰絲氨酸.外泌體也含有與其來源細胞相類似的細胞因子、生長因子等蛋白質,以及脂質、編碼或非編碼RNA等生物活性物質,在細胞之間物質交換過程中具有重要作用.

幾乎所有的外泌體都有微管蛋白、肌動蛋白結合蛋白、四跨膜蛋白.不同細胞來源的外泌體蛋白組成存在差異,但它們有著共同的蛋白質組分,包括膜轉運和融合相關蛋白(Rab GTPases,Annexins,Flotillin等)、多囊泡胞內體產生相關蛋白(Alix, TSG101等)、分子伴侶(HSP70,HSP90)、整合素和四跨膜蛋白超家族(CD63,CD9,CD81,CD82等),這些成分反映了其生物起源[4,5].外泌體可通過受體依賴性調控機制直接刺激受體細胞,也可通過轉運質膜受體、功能性蛋白、mRNA、miRNA和細胞器調控受體細胞[6].同時,外泌體可攜帶多種反映細胞來源的組織/細胞類型特異性蛋白,其蛋白成分也隨來源細胞的不同而存在差異,如抗原提呈細胞分泌的外泌體質膜上含有MHC-I和MHC-Π共刺激蛋白CD80和CD86;來源于血小板的外泌體質膜上有血管性血友病因子和整合蛋白CD41a;T淋巴細胞分泌的外泌體表面含有穿孔蛋白和顆粒酶.外泌體中含有各種mRNA、miRNA及siRNA等,mRNA可以在受體細胞中翻譯出相應的蛋白質,miRNA通過降解或者抑制mRNA的翻譯來調控蛋白質在目標細胞中的表達,siRNA可以敲除受體細胞中的目標基因達到基因沉默的作用[7].

微泡(Microvesicles)是廣泛存在于正常細胞和腫瘤細胞的胞外細胞器樣結構,能運載多種特異性蛋白、微小RNA及DNA片段,在細胞間物質和信息轉導中起重要作用.微泡可能含有多種亞型,包括外泌體、脫落小泡(shedding vesicles,SV)、分泌性微泡、膜顆粒及外泌體樣小泡等,這些命名是否存在概念的重合尚不明確.外泌體是細胞經過"內吞-融合-外排"等一系列調控過程而形成的細胞外納米級小囊泡,其膜上含有GPI鉚定蛋白、CD63、TNFR1,其分泌主要依靠轉運必需內吞體分選復合物,多數為持續性釋放.然而,SV一般大于200nm,甚至超過1μm,無規則形狀,含有收縮蛋白、金屬蛋白酶及整合素,脂類成分以膽固醇為主,一般不會持續釋放[8].

2 外泌體的提取和鑒定

外泌體提取的方法有離心法、過濾離心法、密度梯度離心法、免疫磁珠法和色譜法等[9],但沒有一種方法能同時保證外泌體的含量、純度、生物活性.離心法是外泌體提取常用的方法,得到的外泌體量多,但是純度不足,而且這種物理作用可導致外泌體結構及大小的改變.過濾離心法是利用不同截留相對分子質量(MWCO)的超濾膜離心分離外泌體,這種操作簡單、省時,不影響外泌體的生物活性,但分離的外泌體純度也不足.外泌體目前廣泛應用的提取方法是蔗糖密度梯度超速離心法,通過逐步去除細胞、細胞碎片,在高達100 000g離心力的情況下得到富含外泌體的沉積物,在蔗糖梯度液中將其中含有與外泌體非特異性結合的蛋白質、蛋白質聚集物等雜質超速離心進行進一步的純化.此種方法分離得到的外泌體純度高,但前期準備工作繁雜,耗時,量少.免疫磁珠法是利用包被有單克隆抗體的球型磁性微粒特異性結合靶物質得以分離外泌體,這種方法可以保證外泌體形態的完整,特異性高、操作簡單、不需要昂貴的儀器設備,但是非中性pH和非生理性鹽濃度會影響外泌體的生物活性,不便進行下一步的實驗.另外,根據凝膠孔隙的孔徑大小與樣品分子尺寸的相對關系,利用色譜法也可對外泌體進行分離,此法分離到的外泌體在電鏡下大小均一,純度高,但需要特殊的設備,應用不廣泛.

外泌體是細胞內內溶酶體微粒內陷形成多囊泡體,并在刺激作用下多囊泡體與細胞膜融合向胞外分泌的大小均一,直徑為40~100nm的囊泡,可以通過電鏡進行觀察;外泌體的特異性蛋白包括Alix、Flotillin-1、Lamp-1、Lamp-2、CD63和CD9等[10],可通過免疫印跡分析以及流式細胞儀進行鑒定.目前的實驗技術主要依靠離心速率法來分離各類微泡,但物理作用能導致微泡結構及大小的改變,流式細胞儀可以同時檢測物質的大小和密度,但300nm以下的囊泡無法被測到.微泡沒有獨特的表面標志物,其膜脂質成分、蛋白組成、密度也還需進一步檢測.

3 外泌體在疾病診斷的研究進展

在疾病診斷方面,外泌體含有蛋白質,mRNA, miRNAs等信號分子,它們反映分泌細胞的生理狀態和功能狀態,甚至還會包含細胞病態相關的分子信息,從而提供了豐富的潛在的生物標志物分子源.臨床研究已發現,不同疾病的不同類型細胞都能分泌含有RNAs的外泌體,這使得從人體體液中純化外泌體,再對其RNA成分及序列分析成為可能,有望用于疾病診斷及監測,尤其在腫瘤標志物檢測方面.外泌體作為生物標志物雖然還處于起步階段,但隨著進一步的研究,外泌體的臨床應用可能會有良好的前景.

3.1 外泌體在腫瘤疾病診斷中的應用腫瘤是威脅人類健康和生存最主要的疾病之一,惡性腫瘤發病率和死亡率日趨增高,給社會和家庭帶來沉重的經濟和疾病負擔.腫瘤在生長過程中會不斷地將外泌體釋放到周圍環境中,外泌體含有miRNA,因此檢測體液中的外泌體及外泌體RNA有助于腫瘤診斷和預后判斷,Rosell等[11]對非小細胞肺癌的相關研究得出了相似的結果.miRNA不僅是遺傳信息的內源性調控者,也是調節細胞通訊的分泌因子及疾病的生物標志物.miRNA作為一種在某些腫瘤中可能出現異常表達的非編碼的RNAs,可以作為腫瘤診斷和預后判斷的生物標志物[12].Taylor等[13]發現卵巢癌患者與正常人血液中外泌體的miRNA圖譜有明顯的差異,說明外泌體有助于卵巢癌的診斷;并且還發現從血清中分離出的腫瘤來源外泌體中的miRNA與卵巢癌組織中提取出的miRNA具有很好的相關性,以及患者組與正常對照組的miRNA圖譜分析結果也顯示出明顯的差異.卵巢癌患者血清中的外泌體有8種miRNA顯著增加[13],另外,也有研究[14]發現卵巢癌患者的腹水和血清中可檢測到蛋白CD24和EpCAM的表達.

2008年Mitchell等[15]發現miR-141是前列腺癌的一個可靠的診斷標志物,且有研究[16]證明血清miR-141與miR-375水平與前列腺癌的腫瘤進展相關.Nilsson等[17]發現在前列腺癌患者尿中的外泌體有蛋白標記物5T4,前列腺癌基因-3(PCA-3)和mRNA(TMPRSS2-ERG)的表達存在,在前列腺癌患者尿外泌體中也檢測到PSA和PSMA的表達,但它們在尿中表現出了極大的變異.另外,前列腺癌患者的尿中也有miR-107和miR-574-3p上調的實驗研究[18],血漿中的外泌體均有存活素(Survivin),前列腺癌存活素的表達與健康者和良性前列腺增生相比上調了.經免疫印跡法和流式細胞儀分析[19],膀胱腫瘤細胞來源的外泌體在膀胱腫瘤中可能檢測到蛋白質的陽性表達,其中重要的有外泌體中CD36,CD44的表達在健康和疾病狀態有明顯的差別.

CA19-9仍然是胰腺癌最可靠的診斷血清標記物,但可結合其他診斷工具,如胰腺癌患者血清miRNA可鑒別疾病是良惡性腫瘤還是炎癥[14], Wang等研究[20]證實了胰腺癌血清中外泌體攜帶胰腺癌干細胞標記物.另外,外泌體miRNA也可作為肺癌的診斷標志物[21].Logozzi等[22]發現血漿外泌體中CD63+可作為黑色素瘤的蛋白標志物.膠質母細胞瘤患者血清中可檢測到腫瘤特異性的表皮生長因子受體(EGFRⅧ)[23],血清miR-21在膠質母細胞瘤體中增加了40倍.

可見,臨床分析證明外泌體對實體腫瘤如卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌、肺癌等有一定的作用,外泌體miRNA的數量可能與腫瘤的大小變化有關,腫瘤患者血清的外泌體數量可能也與腫瘤的分期、分級相關.靶向癌癥的外泌體的標志物可能為腫瘤疾病的診斷和治療提供新的指標和途徑,對腫瘤高危人群早期診斷和早期治療以降低或減緩腫瘤病例的發生發揮重要的作用.

3.2 外泌體在非腫瘤疾病診斷中的應用在過去幾年,外泌體在腎臟疾病的研究越來越受到關注.尿中發現外泌體意義很大,尿樣標本外泌體蛋白圖譜分析可能具有相當重要的診斷提示作用.尿蛋白組學檢查,包括游離蛋白和外泌體蛋白圖譜檢查,可以為多種疾病的診斷和鑒定提供了尿樣標本生物標志物.研究人員發現[24]尿外泌體中的胎球蛋白-A在嚙齒類動物的腎毒性暴露后幾個小時內就升高了50倍,且在觀察尿肌酐的變化之前胎球蛋白-A在急性腎損傷患者已明顯升高.最近的一項研究[25]顯示,相比局灶節段性腎小球硬化患者,微小腎臟病變患者糖蛋白B7-1在尿沉渣中mRNA比值增加了.也有研究[26]發現尿顆粒酶mRNA水平可能區分細胞排斥反應與急性腎損傷患者.

外泌體的分離可能會提高尿mRNA分析的靈敏度和精確度.研究發現[27]IgA腎病患者尿中幾種miRNAs(miR-200a,miR-200b和miR-429)豐度的減少了,并且其減少的程度與疾病的嚴重程度相關.尿中外泌體和外泌體miRNA以及其定量PCR準確檢測的穩定性,進一步支持其成為在腎臟病中潛在的非侵入性的生物標志物.分析尿樣本中外泌體的蛋白圖譜還可能協助腎臟疾病的診斷(表1)[28].

表1 與腎疾病相關的尿液外泌體蛋白質

目前研究發現羊水和乳汁等體液中檢測到的外泌體也發揮一定的作用.Ke11er等[29]通過RTPCR分析羊水中的外泌體,發現外泌體存在編碼ZFY(人類Y染色體的性別決定區編碼一種鋅指蛋白)的mRNA,可用于胎兒性別的判斷.人乳汁提取的外泌體中含有59種與免疫功能相關的microRNA,占已經確定的免疫功能相關microRNA總量的67%[30].Welker等[31]研究表明血清外泌體中CD81在慢性丙型肝炎患者中表達升高,并且其與炎癥纖維化的嚴重程度相關,提示外泌體CD81可能是丙型肝炎診斷一個潛在的蛋白標志物.外泌體還可以運載很多與神經系統疾病相關的microRNA成分(表2)[32].

表2 神經系統疾病相關microRNA在外泌體中的分布

總之,外泌體可以作為蛋白質和RNA的生物標志物的來源.外泌體存在于許多體液中,如血清、尿液、唾液、腹水、羊水、乳汁等,獲取方便,由于其標記蛋白以及miRNA的選擇性富集,使外泌體成為一種非常有吸引力的非侵入性的疾病診斷手段.

4 外泌體在疾病治療的研究進展

4.1 外泌體在腫瘤疾病治療中的研究進展外泌體作為一種新型的非細胞腫瘤疫苗,國內外學者進行了大量的相關研究.自從1998年Ziwogel等[33]首先使用樹突狀細胞來源的外泌體(Dexo)作為腫瘤疫苗,在動物模型中應用負載腫瘤抗原的Dexo使荷瘤小鼠腫瘤得以消退后,樹突狀細胞來源的外泌體(Dexo)和腫瘤細胞來源的外泌體(Texo)的抗腫瘤免疫作用得到了深入的研究,其中部分研究已進入I期臨床試驗階段.前者主要通過刺激T細胞的體外增殖分化來誘導體內的抗腫瘤免疫效應,后者通過抗原提呈細胞交叉呈遞給細胞毒性T淋巴細胞(CTL),使其產生腫瘤殺傷作用.研究[34]顯示,從骨髓瘤細胞系J558分離的Texo表達P1A腫瘤抗原,能夠誘導抗J558腫瘤作用,使得80%的免疫小鼠獲得抗腫瘤免疫保護,同樣自體及異基因含有MUC1腫瘤抗原的Texo,能誘導CTL效應并能抑制表達MUC1腫瘤細胞的生長.王麗英等[35]利用負載乳腺癌抗原臍血Dexo,促進同種異體T細胞增殖,并能誘導特異性抗乳腺癌的免疫效應.陳紹倩等[36]研究表明人白血病細胞株K562細胞分泌的外泌體及K562細胞總RNA刺激人Dexo能夠誘導出K562細胞特異性CTL效應,發揮特異性抗白血病細胞的免疫反應.

目前有大量研究表明外泌體具有抗腫瘤免疫的作用,但外泌體在腫瘤免疫逃逸中作用的研究也比較多.有研究報道,腫瘤細胞來源的外泌體可以通過表達FasL來誘導CD8+T細胞凋亡,導致腫瘤的免疫逃逸.Clayton等[37]的一項研究表明,外泌體可以選擇性地抑制白細胞介素-2(IL-2)的功能,使其只發揮促進調節性T細胞的作用,而不表現其促進CTL的增殖和分化的功能.外泌體也可能誘導腫瘤血管新生并促進腫瘤轉移.有研究[38]顯示,腫瘤實體來源的外泌體在中低劑量時表現出對腫瘤細胞的促增殖作用,在高劑量時則表現為抑制增殖作用.

4.2 外泌體在非腫瘤疾病應用的研究進展外泌體在自身免疫性疾病和缺血性疾病治療方面,都取得一定的研究進展.未成熟的樹突細胞通過免疫抑制因子修飾后,可以分泌具有抑制自身免疫的外泌體,機體注射外泌體后可減輕炎癥性腸病、類風濕性關節炎等疾病[39].研究[40]發現人CD34+造血干細胞可以分泌具有促血管形成作用的外泌體,對缺血性疾病具有改善作用.2011年Alvarez等[41]首次成功利用外泌體治療了鼠的阿爾茨海默病模型,顯著下調了阿爾茨海默病相關蛋白的表達(蛋白下降62%),減少了B淀粉的沉積.相關研究[42]已證實來源于胚胎干細胞(ESCs)和某些成體干細胞的外泌體可以改變受體細胞的生理功能,從而保護急性損傷的心臟、肝臟和腎臟;與干細胞的移植治療相比,外泌體可以避免細胞移植引起的長期異常分化和腫瘤形成,因此通過干細胞來源的外泌體進行調控血管生成和促進損傷細胞修復有望成為組織損傷修復的治療新策略.外泌體包含多種蛋白質和遺傳物質,表明蛋白質等大分子物質可以裝載到外泌體上.外泌體可穿透細胞膜釋放mRNA到靶細胞,使受體細胞翻譯轉染mRNA,并且外泌體廣泛分布于不同體液,在體內有較長的半衰期,因此,利用電穿孔或脂質體轉染的方式直接把藥物轉入外泌體或者將編碼興趣蛋白質的基因轉入分泌外泌體的細胞,外泌體也可能成為一種理想的藥物載體[43].

5 展望

長期以來,針對外泌體的研究大多集中于研制安全而有效的非細胞腫瘤疫苗.該疫苗表達特異的腫瘤抗體能刺激免疫系統抑制腫瘤生長,但該疫苗發展的瓶頸在于制備時必須使用已接受過治療的患者的DC細胞,同時外泌體所負載的抗原大量變異,廣譜性不高.然而,外泌體作為疾病診斷的生物標志物,目前的研究還不多.外泌體包含多種蛋白質和遺傳物質,并且廣泛分布于不同體液中,在體內有較長的半衰期,所以,外泌體可作為一種無創或微創的非侵入疾病診斷手段,一定條件下能夠代替組織活檢減輕患者的痛苦,提高疾病早期診斷率.因此,如何在各種體液中檢測到針對疾病特異性的外泌體生物標志物將是值得努力探索的目標之一.

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R730.5,R730.23

A

1674-1129(2014)03-0267-05

10.3969/j.issn.1674-1129.2014.03.012

2014-02-18;

2014-04-02)

國家自然科學基金(No.81360083)

劉艷華,女,1988年出生,規范化培訓學員,主要研究方向為:臨床檢驗診斷.

王小中,男,出生于1973年,教授,主要研究方向為血液病分子機制及診斷.