β－環(huán)糊精對(duì)多菌靈的熒光增敏效應(yīng)研究

姜慧明，楊 紅

(大連民族學(xué)院a.生命科學(xué)學(xué)院;b.環(huán)境與資源學(xué)院，遼寧大連 116605)

β－環(huán)糊精是一種具有疏水空腔和親水表面的超分子主體化合物，具有分子識(shí)別功能，能夠選擇性地結(jié)合有機(jī)分子形成主客體超分子化合物。β－環(huán)糊精超分子包合物具有許多特點(diǎn)，比如溶解性能、化學(xué)性能、pKa值、擴(kuò)散性能、電化學(xué)性能以及光化學(xué)性能等［1］。目前認(rèn)為，β－環(huán)糊精引起熒光增強(qiáng)的主要因素是增加發(fā)射速度常數(shù)，減少分子移動(dòng)自由度，避免去活碰撞，保持適宜的微環(huán)境以及保護(hù)激發(fā)態(tài)不與大體積水分子和猝滅劑接觸。段云青等［2］通過(guò)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)推測(cè)，溴敵隆結(jié)構(gòu)中的疏水基團(tuán)4－羥基香豆素母環(huán)或者溴代聯(lián)苯基進(jìn)入了β－環(huán)糊精的疏水空腔之中，形成超分子包絡(luò)物引起熒光顯著增強(qiáng)，這為環(huán)糊精熒光增強(qiáng)機(jī)理的研究提供了必要的依據(jù)。但是目前對(duì)其熒光增敏機(jī)理的研究還基本處于推測(cè)階段。

多菌靈(carbendazim)，化學(xué)名稱(chēng)為N－(2－苯駢咪唑基)－氨基甲酸甲酯，又名棉萎靈、苯井咪唑44號(hào)，結(jié)構(gòu)式如圖1。

圖1 多菌靈的結(jié)構(gòu)

多菌靈是一種高效低毒內(nèi)吸性殺菌劑，對(duì)農(nóng)作物具保護(hù)和治療作用。對(duì)子囊菌亞門(mén)、半知菌亞門(mén)病原真菌有效，對(duì)鞭毛菌亞門(mén)真菌和細(xì)菌無(wú)抑制活性，可用于防治禾谷類(lèi)作物、棉花、油菜和其他作物的多種病害。多菌靈化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，能被植物的種子、根和葉吸收，殘效期較長(zhǎng)，對(duì)人、畜均有一定毒性，可引起抽搐、精神恍惚、惡心嘔吐、胸悶、頭暈等中毒癥狀。因此，有關(guān)多菌靈殘留量的分析已經(jīng)越來(lái)越受到重視。

雖然多菌靈在農(nóng)作物病害的防治方面有著廣泛的應(yīng)用，但對(duì)人體又有一定的毒害性，目前世界許多國(guó)家都制定了多菌靈在不同種(類(lèi))農(nóng)副產(chǎn)品中殘留量的最高限量標(biāo)準(zhǔn)。加拿大國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定黃瓜、西葫蘆等蔬菜中多菌靈殘留量每公斤不得超過(guò)0.5 mg;馬來(lái)西亞規(guī)定蔬菜類(lèi)中多菌靈殘留量每公斤不得超過(guò)1 mg;中國(guó)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GBl4870－94中規(guī)定蔬菜、水果中多菌靈殘留量每公斤不得超過(guò) 0.5 mg。

多菌靈的測(cè)定目前主要采用液液萃取法［3］、固相萃取法［4－5］和二氧化碳超臨界萃取法［6］等;測(cè)定方法主要有分光光度法［7］、毛細(xì)管電泳法［4］、氣相色譜法［8］、液相色譜法及液相色譜質(zhì)譜法［9］等，熒光法尚未進(jìn)行深入研究。

本文探討了多菌靈的熒光光譜，以及在β－環(huán)糊精存在下多菌靈的熒光增強(qiáng)效應(yīng)，旨在建立一種快速高效的熒光測(cè)定多菌靈含量的方法，為以β－環(huán)糊精作為超分子主體化合物對(duì)客體分子的熒光增敏效應(yīng)研究提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器及試劑

儀器:RF－5301PC熒光分光光度計(jì)(SHIMADZU，日本)。

試劑:多菌靈，純度99.9%(沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)植保學(xué)院農(nóng)藥研究室友情贈(zèng)送)，配成0.08 mg·mL－1的乙醇/水溶液;β－環(huán)糊精(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，二次重結(jié)晶，60℃真空干燥后配成0.01mol·L－1水溶液;羥丙基環(huán)糊精(HPCD，上海源葉生物科技有限公司)，二次重結(jié)晶，60℃真空干燥后配成0.01 mol·L－1水溶液。實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

Britton－Robinson(B－R)緩沖溶液的配置:取 H3BO30.6183 g，85% 的 H3PO40.68 mL，36%的乙酸1.16 mL，用蒸餾水配成250 mL的三酸混合液;再取2.0 g NaOH，配置成0.2 mol·L－1溶液，將配好的三酸混合液與NaOH溶液以不同體積混合，可配置成不同pH的B－R緩沖溶液。

1.2 方法

移取一定量的多菌靈溶液，加入不同量的B－R緩沖溶液及β－環(huán)糊精或HPCD溶液后移入25 mL比色管中，加水定容，室溫下振蕩10 min，然后測(cè)定溶液的相對(duì)熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果與討論

多菌靈的激發(fā)和發(fā)射譜如圖2，確定測(cè)定波長(zhǎng)λex/em=284/306 nm。

圖2 多菌靈的激發(fā)和發(fā)射譜(狹縫寬度均為5 nm)

2.1 β－環(huán)糊精濃度的影響及包合常數(shù)測(cè)定

在確定了多菌靈的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)后，筆者在多菌靈溶液中加入了不同濃度的β－環(huán)糊精，得到了一系列熒光光譜，見(jiàn)表1和圖3。

表1 不同β－環(huán)糊精濃度下多菌靈的熒光強(qiáng)度

圖3 不同β－環(huán)糊精濃度下多菌靈的熒光發(fā)射光譜(狹縫寬度均為5 nm)

β－環(huán)糊精濃度對(duì)多菌靈熒光強(qiáng)度的影響如圖4。

圖4 β－環(huán)糊精濃度對(duì)多菌靈熒光強(qiáng)度的影響

由表1和圖3、圖4可以清楚看出，多菌靈溶液在加入β－環(huán)糊精后，熒光強(qiáng)度有了明顯的增強(qiáng)。在β－環(huán)糊精的濃度范圍為8×10－4～5.6×10－3mol·L－1，多菌靈的熒光強(qiáng)度隨著 β － 環(huán)糊精濃度的增加而增強(qiáng)，繼續(xù)增加β－環(huán)糊精的濃度，熒光強(qiáng)度呈下降趨勢(shì)。

β－環(huán)糊精對(duì)多菌靈的的熒光增敏作用是由于多菌靈在疏水作用、范德華力及氫鍵力等非共價(jià)鍵作用的驅(qū)動(dòng)下，進(jìn)入β－環(huán)糊精空腔形成超分子包合物，在空腔內(nèi)多菌靈分子的運(yùn)動(dòng)自由度以及水分子的松弛效應(yīng)大大降低，阻止了碰撞失活，減少了非輻射躍遷的幾率;環(huán)糊精空腔所提供的非極性微環(huán)境近似于有機(jī)介質(zhì)［10］，使多菌靈分子的熒光在β－環(huán)糊精空腔中受到保護(hù)和屏蔽，減少了與腔體外主體溶液中水分子、氧等碎滅劑的接觸;空腔尺寸大小與極性對(duì)客體進(jìn)行選擇性識(shí)別包結(jié)。據(jù)此，本實(shí)驗(yàn)建立了水溶液中高靈敏度與高選擇性測(cè)定多菌靈的熒光光譜法。

假設(shè)在β－環(huán)糊精包合體系中，主客體的化學(xué)計(jì)量比為1∶1，即S+CD?CD－S，則包合物的形成常數(shù) K=［CD － S］/［S］［CD］，其中［S］［CD］［CD－S］分別表示客體S、主體CD和包合物CD－S的平衡濃度。根據(jù)Benesi－Hildebrand的雙倒數(shù)法，得到如下公式:

式中，F(xiàn)指在不同β－環(huán)糊精濃度下分別測(cè)得的熒光強(qiáng)度;F0指不加β－環(huán)糊精，多菌靈溶液測(cè)得的熒光強(qiáng)度;F∞指所有的多菌靈完全被β－環(huán)糊精環(huán)糊精包合后，測(cè)得的熒光強(qiáng)度。一般控制CD濃度遠(yuǎn)大于S濃度，因此［CD］可用其原始濃度表示。

將所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)按1/(F－F0)對(duì)1/［CD］作圖，可得一線(xiàn)性關(guān)系較好的直線(xiàn)(R=0.992 7)，說(shuō)明主客體間形成了1∶1的超分子包合物。由直線(xiàn)的截距與斜率之比可求得β－環(huán)糊精－多菌靈的結(jié)合常數(shù) K=3.2 ×102(L·mol－1)，如圖5。

圖5 β－環(huán)糊精－多菌靈一元包合物關(guān)系式方程曲線(xiàn)

假設(shè)在環(huán)糊精包合物中，主客體的化學(xué)計(jì)量比為2∶1，則 S+2β －CD?(β －CD)2－S。

將測(cè)得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)按1/(F－F0)對(duì)1/［CD］2作圖，不呈直線(xiàn)(如圖6)，因此主客體的化學(xué)計(jì)量比不是2∶1。

圖6 β－環(huán)糊精－多菌靈二元包合物關(guān)系式方程曲線(xiàn)

2.2 pH值對(duì)多菌靈熒光強(qiáng)度的影響

β－環(huán)糊精對(duì)堿穩(wěn)定，但在強(qiáng)酸性介質(zhì)中將分解為由開(kāi)環(huán)產(chǎn)物直至葡萄糖組成的混合物。本文探討了pH=2.0～10.0范圍內(nèi)β－環(huán)糊精與多菌靈包結(jié)及其對(duì)熒光強(qiáng)度的影響，結(jié)果如圖7。體系的pH值是由B－R緩沖溶液來(lái)調(diào)節(jié)的。

圖7 pH值對(duì)β－環(huán)糊精包結(jié)多菌靈熒光強(qiáng)度影響的工作曲線(xiàn)

由圖7可以看出，在中性、弱酸性、弱堿性條件下，β－環(huán)糊精包結(jié)多菌靈的熒光強(qiáng)度都很強(qiáng)，其中以pH=7.6的溶液熒光強(qiáng)度最大。在強(qiáng)酸性溶液中(pH=2.29～4.06)，多菌靈的熒光強(qiáng)度發(fā)生了很大變化，306 nm處的發(fā)射峰基本消失了，這預(yù)示著多菌靈的結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。由多菌靈的結(jié)構(gòu)可以看出，多菌靈在酸性溶液中會(huì)變成銨鹽，從而改變了其熒光吸收性質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)選擇pH=7.6作為熒光測(cè)定的最佳pH值。

2.3 工作曲線(xiàn)、檢測(cè)下限和精密度

由表1看出，當(dāng)β－環(huán)糊精的濃度為5.6×10－3mol·L－1時(shí)，多菌靈的熒光強(qiáng)度最大，因此在測(cè)定多菌靈的工作曲線(xiàn)時(shí)，固定β－環(huán)糊精的濃度為5.6 ×10－3mol·L－1而改變多菌靈的質(zhì)量濃度，得到了多菌靈在不同質(zhì)量濃度時(shí)的熒光強(qiáng)度，見(jiàn)表2和圖9。

表2 多菌靈不同濃度時(shí)的熒光強(qiáng)度(固定 β －環(huán)糊精的濃度為 5.6×10－3mol·L－1)

圖8 不同濃度多菌靈的熒光強(qiáng)度曲線(xiàn)(狹縫寬度均為5 nm)(譜圖自下而上編號(hào)依次為15，14，13…10)

圖9 多菌靈的工作曲線(xiàn)

由圖9可以看出，多菌靈在0.46～6.16 ng·mL－1范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線(xiàn)性關(guān)系，回歸方程為F=5.37 C(ng·mL－1)+148.54，相關(guān)系數(shù)為0.999 3。依照 IUPAC規(guī)定，CL=kS0/S，其中 CL為檢測(cè)下限，k為與置信水平相關(guān)的常數(shù)，S0為n次空白溶液測(cè)定值的標(biāo)準(zhǔn)偏差(S0=0.11)，S為標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)的斜率。當(dāng)置信水平為90%時(shí)k取3，計(jì)算求得本法的檢測(cè)限為0.06 ng·mL－1。0.77 ng·mL－1多菌靈標(biāo)準(zhǔn)溶液9次平行測(cè)得值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.2%。

3 結(jié)論

本文討論了多菌靈在與β－環(huán)糊精包合后的熒光光譜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在pH=7.6的溶液中，β－環(huán)糊精對(duì)多菌靈具有很強(qiáng)的熒光增強(qiáng)效應(yīng)，且形成了1∶1的超分子體系，包合常數(shù)K=3.2×102(L·mol－1)。隨著熒光強(qiáng)度的增強(qiáng)，該體系對(duì)多菌靈的檢測(cè)限也大大提高，達(dá)到了60 pg·mL－1，是目前已經(jīng)發(fā)表的最好結(jié)果 4.78 ng·mL－1［11］的百分之一，該研究結(jié)果對(duì)提高農(nóng)藥殘留檢測(cè)靈敏度具有比較重要的應(yīng)用價(jià)值。

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(責(zé)任編輯 鄒永紅)