生長抑制因子4和人表皮生長因子受體2在結直腸癌中的表達及其與預后的關系

劉俊遠，黃桂林，張玉婷

結直腸癌是消化系統最常見的惡性腫瘤之一，全球范圍內結直腸癌發病率居惡性腫瘤第三位[1]。在我國，結直腸癌的發病率和病死率呈逐年上升趨勢[2]，對患者的生活質量造成了嚴重影響。生長抑制因子4 (inhibitor of growth family member 4,ING4) 是近年來新發現的候選抑癌基因，在腫瘤的增殖、轉移過程中發揮重要作用。人表皮生長因子受體2 (caudal type homeobox transcription factor 2,HER2)是人類原癌基因之一，近年來其在結直腸癌發生、發展中的作用越來越受到關注。本研究通過免疫組織化學法檢測ING4和HER2在結直腸癌組織中的表達，觀察ING4、HER2與臨床病理特征及預后的關系，初步探討其在結直腸癌的發生、發展及預后判斷方面的價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集2007年1月—2008年4月石河子大學醫學院第一附屬醫院經病理檢查確診為原發性結直腸癌患者99例，取其病理組織的石蠟標本共99份作為結直腸癌組。99例患者中男51例，女48例;年齡30～85歲，平均(62.9±11.8)歲。其中結腸癌36例、直腸癌63例；高分化9例、中分化75例、低分化15例;無淋巴結轉移57例、淋巴結轉移42例；T1期6例、T2期25例、T3期52例、T4期16例;TNM分期：Ⅰ期26例，Ⅱ期28 例，Ⅲ期37 例，Ⅳ期8 例。99例患者均行結直腸癌根治術治療，術前均未接受放療和化療，臨床及病理資料完整。術后采用電話及門診復查進行隨訪，隨訪起點為確診之日，隨訪終點為患者出現死亡、失訪或至截止時間(2013-05-30)。隨訪結束時，獲得完整隨訪資料者87例，隨訪完成率為 87.9%，其中35例結直腸癌患者死亡。同時選擇30例原發性結直腸癌患者距腫瘤>5 cm的癌旁正常組織作為對照組。

1.2 研究方法

1.2.1 主要試劑 兔抗人ING4多克隆抗體(ab113425)購自美國abcam公司，兔抗人HER2單克隆抗體、Envision試劑盒及DBA試劑盒購自北京中杉金橋生物科技有限公司。

1.2.2 免疫組織化學方法 石蠟包埋的結直腸癌標本行4 μm厚連續切片，染色步驟嚴格按Envision試劑盒的操作說明進行；ING4、HER2抗體均按1∶200稀釋，以PBS液代替一抗作為陰性對照。

1.2.3 結果判定 由2名高年資病理科醫師在雙盲情況下進行染色評分。ING4陽性表達以細胞核和/或細胞質內出現棕黃色顆粒為準；使用半定量的評分系統來評估抗體的染色效果，計數5個高倍視野或500個細胞。按染色強度計分:0分為無色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色；按陽性細胞所占百分比計分：0分為陰性，1分為陽性細胞數≤10%，2分為陽性細胞數11%～50%，3分為陽性細胞數51%～75%，4分為陽性細胞數>75%；染色強度計分與陽性細胞所占百分比計分乘積：0～2分為(-)，3～5分為(+)，6～9分為(++),10～12分為(+++)。HER2以細胞膜出現棕黃色為陽性，染色結果分成4級：(-)為<10%細胞膜無著色或不連續的輕微著色,(+)為>10%細胞膜連續的輕至中度著色,(++)為>10%細胞膜連續的中度著色,(+++)為>10%細胞膜連續的強著色；(-)和(+)視為無或低表達,(++)及(+++)視為高表達。

1.3 統計學方法 采用SPSS 17.0軟件對實驗數據進行統計學處理，計數資料的分析采用χ2檢驗；相關性檢驗采用Spearman相關性分析；采用Kaplan-Meier乘積極限法計算累計生存率并繪制生存曲線；采用log-rank檢驗比較生存率。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ING4、HER2在結直腸癌組和對照組中的表達 ING4在結直腸癌組陽性表達率為68.7%(68/99，見圖1)，ING4在對照組陽性表達率為93.3%(28/30)，結直腸癌組ING4陽性表達率低于對照組，差異有統計學意義(χ2=7.346，P<0.05)。HER2在結直腸癌組陽性表達率為35.4%(35/99，見圖1)，HER2在對照組陽性表達率為6.7%(2/30)，結直腸癌組HER2陽性表達率高于對照組，差異有統計學意義(χ2=9.262，P<0.05)。

注：A為ING4的陽性表達，B為HER2的陽性表達

圖1 結直腸癌組織中ING4、HER2的陽性表達(免疫組化Envision法，×400)

Figure1 The positive expression of ING4，HER2 in the colorectal cancer

2.2 ING4、HER2的表達與結直腸癌臨床病理特征的關系 ING4的表達與浸潤深度、分化程度、淋巴結轉移及TMN分期相關(P<0.05)，與性別、年齡、腫瘤大小及腫瘤部位無關(P>0.05)。HER2的表達與浸潤深度、淋巴結轉移及TMN分期相關(P<0.05)，與患者的性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤部位及分化程度無關(P> 0.05，見表1)。

表1 ING4、HER2表達與結直腸癌臨床病理特征的關系〔n(%)〕

Table1 Relationship between expression of ING4，HER2 and clinicopathologic factors of colorectal cancer

例數ING4陽性表達χ2值P值HER2陽性表達χ2值P值性別 男5136(706)0177067420(392)06870407 女4832(667)15(313)年齡(歲) <603321(636)0587044412(364)00220882 ≥606647(712)23(348)腫瘤大小(cm) ≤55642(750)2389012221(375)02600610 >54326(605)14(326)腫瘤部位 結腸3623(639)0605043612(333)01010751 直腸6345(714)23(365)浸潤深度 T1+T23129(935)12970<00015(161)72980007 T3+T46839(574)30(441)分化程度 高分化98(889)1117700043(333)00570959 中分化7555(733)27(360) 低分化155(333)5(333)淋巴結轉移 無5744(772)4520003412(210)120230001 有4224(571)23(548)TMN分期 Ⅰ+Ⅱ5444(815)9042000310(185)14732<0001 Ⅲ+Ⅳ4524(533)25(556)

2.3 結直腸癌組ING4、HER2表達的相關性 結直腸癌組ING4與HER2的表達呈負相關(rs=-0.412，P<0.001，見表2)。

表2 ING4與HER2表達的相關性

Table2 Correlation between ING4 and HER2 expressions in colorectal cancer

ING4HER2+ -合計+155368-201131合計356499

2.4 結直腸癌組織中ING4、HER2的表達與預后的關系 ING4陰性者5年生存率為35.5%(11/31)，ING4陽性者5年生存率為77.9%(53/68)，兩組生存率間差異有統計學意義(χ2=16.721，P<0.001，見圖2)。HER2陰性者5年生存率為78.1%(50/64)，HER2陽性者5年生存率為40.0(14/35)，兩組生存率間差異有統計學意義(χ2=16.551，P<0.001，見圖3)。

圖2 結直腸癌組織中ING4的表達與5年生存率的關系

Figure2 The survival curve between ING4 positive group and ING4 negative group in the colorectal cancer

圖3 結直腸癌組織中HER2的表達與5年生存率的關系

Figure3 The survival curve between HER2 positive group and HER2 negative group in the colorectal cancer

3 討論

ING4屬于生長抑制因子家族，該家族與細胞周期調控、細胞凋亡、DNA損傷修補及血管生成密切相關[3]。ING4廣泛參與腫瘤發生、發展的多個過程，Shiseki等[4]研究發現，ING4通過上調p53的轉錄活性，擾亂正常的細胞周期進程，使細胞生長停滯，促進細胞凋亡；Shi等[5]發現，ING4可以與核轉錄因子(NF-κb)結合，使白介素8(IL-8)表達水平下降，導致腫瘤血管生成減少。低氧誘導因子(HIF)是組織細胞為適應缺氧環境所產生的關鍵因子，Ozer等[6]研究發現，ING4能夠明顯抑制缺氧狀態下HIF靶基因(如Nip3、AK3等)的表達，從而抑制細胞對缺氧環境的適應，抑制腫瘤細胞的生長。ING4在正常組織中表達豐富，在多種惡性腫瘤組織中的表達明顯下調，其在胃癌組織中的陽性表達率為54.5%[7]，在結直腸癌中的陽性表達率為63.3%[8]。本研究結直腸癌組織中ING4陽性表達率為68.7%，顯著低于對照組，與文獻報道一致。提示ING4低表達與結直腸癌的發生、發展密切相關。

本研究顯示，ING4低表達與組織分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移及腫瘤分期密切相關，而與年齡、性別、腫瘤大小及部位無關，提示ING4與腫瘤的惡性程度密切相關，并參與了腫瘤的浸潤和轉移。此外本研究還發現，ING4陰性表達組的5年生存率明顯低于陽性表達組。提示ING4表達缺失的結直腸癌患者預后不良。

HER2 基因編碼一種分子量為 185 KD且具有酪氨酸激酶活性的跨膜蛋白質(P185HER2)，在細胞增殖分化、血管生成中發揮重要作用。HER2在乳腺癌及胃癌中的研究較多也較成熟，在乳腺癌中，針對HER2的靶向治療已在臨床上廣泛應用。但近年來有關HER2與結直腸癌的相關研究結果存在較大差異。Park等[9]通過檢測137例結直腸癌標本中HER2的表達，發現HER2在結直腸癌中的表達高于正常結直腸組織，且HER2高表達患者5年生存率明顯降低。吳愛國等[10]通過RNA干擾技術下調大腸癌 HT29 細胞中HER2的表達，發現腫瘤細胞的增殖受到了明顯抑制。但Schuell等[11]發現HER2在結直腸癌組織中表達率低，與患者臨床病理資料無明顯相關性。結果差異較大可能由技術、抗體、結果判斷差異造成，本研究HER2蛋白在結直腸癌中的陽性表達率為35.4%,高于癌旁正常結直腸組織；且HER2表達水平和浸潤深度、淋巴結轉移及腫瘤分期密切相關，HER2陽性表達組的5年生存率明顯低于陰性表達組，提示HER2表達增多，腫瘤的惡性程度增高，易發生浸潤轉移，患者的預后差。

有研究發現，ING4 基因與NF-кb的結合，除了影響IL-8的表達，還可以抑制 NF-κb調節基因COX-2、MMP-9等的轉錄[12]，這些基因在腫瘤血管生成及腫瘤細胞轉移過程中發揮了重要作用。而Lanza-Jacoby等[13]在乳腺癌的研究報道中發現HER2對COX-2的表達具有決定性作用，COX-2的表達在HER2陽性的乳腺癌組織中明顯上升。本研究發現，結直腸癌組織中ING4和HER2蛋白的表達呈負相關，且二者均與預后有關，以上結果提示兩者可能在結直腸癌發生、發展過程中相互影響。兩者聯合檢測可作為評價結直腸癌惡性程度和判斷預后的重要指標，但具體機制還有待進一步探討。本研究仍存在樣本量小等不足，有待今后進一步研究完善。

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