散發性結直腸癌組織p33ING1b啟動子甲基化情況及其意義

張磊昌，何純鋼，曹云飛，鐘 武，鐘世彪，龍軍先，黃永紅，陳利生

結直腸癌是消化系統常見的惡性腫瘤，其發病率位居全球惡性腫瘤的第三位[1]，且其發病率從1992年以來每年以1.2%的速度升高[2]。原衛生部統計數據顯示，我國結直腸癌病死率位居惡性腫瘤第五位，發病率亦呈逐年上升趨勢[3]。結直腸癌的發生、發展是一個多步驟的、涉及遺傳和表觀遺傳變化積累的復雜過程[4]。甲基化是表觀遺傳學多種作用機制中研究得最為廣泛和深入的一種，其與基因的表達抑制和功能喪失有關[5]，在結直腸癌的發生、發展過程中發揮著重要作用[6]。既往研究表明，散發性結直腸癌組織p33ING1b啟動子存在高甲基化現象[7]。p33ING1b是抑癌基因ING1編碼的4種蛋白之一，近年來已成為研究熱點[8]。本研究通過檢測散發性結直腸癌組織p33ING1b啟動子甲基化情況，分析其與患者臨床病理特征及p33ING1b mRNA表達水平的關系，并進行5-氮-2-脫氧胞苷(5-aza-dC)干預實驗，旨在探討p33ING1b在散發性結直腸癌中轉錄抑制的可能機制，為結直腸癌的診斷和治療提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 標本來源 選擇2008年10月—2012年3月在廣西醫科大學第一附屬醫院結直腸肛門外科住院的散發性結直腸癌患者63例，均行結直腸癌根治術并經病理檢查證實，取其癌組織及相應癌旁組織切除標本。63例患者中男36例，女27例；年齡24～81歲，中位年齡58歲；結腸癌28例，直腸癌35例；Dukes分期：A/B期24例，C/D期39例；分化程度：高、中分化腺癌37例，低分化腺癌26例；26例有淋巴結轉移，7例有遠處轉移。同時選擇在我院行吻合器痔上黏膜環切術(PPH)患者13例，收集其術后痔上黏膜組織，均經結腸鏡檢查證實結直腸黏膜無異常。所有樣本獲取過程獲得患者本人同意及本院倫理委員會批準。

1.1.2 細胞株 人結直腸癌細胞株DLD-1、Caco-2均購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

1.1.3 主要儀器和試劑 5-aza-dC購自Sigma公司，亞硫酸氫鈉(NaHSO3)購自S9000 Sigma公司，細胞培養基(高糖DMEM，1640)購自Hyclone公司，TRIzol購自Invitrogen公司，Long Taq DNA聚合酶購自北京天根生物公司，反轉錄試劑盒購自MBI Fermentas公司；多通道PCR儀(PTC-220)購自MJ Research公司，凝膠電泳圖像分析系統(Gel Doc 2000型)購自Bio-Rad公司，紫外分光光度計購自Pharmacia公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 p33ING1b啟動子甲基化檢測 采用巢式-甲基化特異性PCR(nMSP法)：(1)蛋白酶K消化、酚/氯仿抽提、乙醇沉淀，提取癌組織、癌旁組織、痔上黏膜組織DNA，計算DNA濃度及OD260/OD280比值，檢測DNA純度；(2)嚴格按照Methyl Detector Bisulfite Modification Kit說明書步驟對DNA進行NaHSO3修飾及純化；(3)參照文獻[9]并采用Primer軟件設計引物，由上海生物工程技術有限公司合成引物序列(見表1)；(4)PCR反應：第一輪采用修飾的瓊脂糖珠DNA作為模板，使用巢式引物進行PCR，循環參數：預變性94 ℃ 4 min，94 ℃變性30 s、53 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s共35個循環，72 ℃延伸5 min，第二輪模板為第一輪PCR產物，選用甲基化/非甲基化引物進行PCR，循環參數：預變性94 ℃ 4 min，94 ℃變性30 s、62.5 ℃退火30 s、72 ℃延伸25 s共35個循環，72 ℃延伸5 min；(5)PCR產物分析：將第二輪PCR產物在2.5%瓊脂糖凝膠上進行電泳分離，采用凝膠電泳圖像分析系統進行觀察并照相。

表1 p33ING1b啟動子巢式-甲基化特異性PCR和RT-PCR引物序列

Table1 Primer sequence of p33ING1b for nested methylation PCR and RT-PCR

引物名稱引物序列引物長度(bp)巢式-甲基化特異性PCR引物(上游)5′-AGATAAGGTTTAGGGAAGGYGTT-3′441巢式-甲基化特異性PCR引物(下游)5′-AACAACCRCAATAACCAATCTACT-3′甲基化引物(上游)5′-CGGATGGCGTAGGCGCGGGAGTC-3′151甲基化引物(下游)5′-CCGAACACGAACGAAAATAACGACGC-3′非甲基化引物(上游)5′-TGGATGGTGTAGGTGTGGGAGTT-3′151非甲基化引物(下游)5′-CCAAACACAAACAAAAATAACAACACA-3′RT-PCR引物(上游)5′-CTCGTAGCACTCGTCTAGCTCCTT-3′103RT-PCR引物(下游)5′-GAGTCCCTGCCTTTCGACTTG-3′β-actinRT-PCR引物(上游)5′-CACAGAGCCTCGCCTTTGCC-3′106β-actinRT-PCR引物(下游)5′-CACATGCCGGAGCCGTTGTC-3′

1.2.2 癌組織p33ING1b mRNA表達水平 以TRIzol一步法抽提癌組織細胞總RNA，取總RNA 3 μg，采用RT-PCR反轉錄試劑盒，再以反轉錄反應液2 μl作為模板，對p33ING1b mRNA表達水平進行半定量PCR檢測，以β-actin為內參基因(引物序列見表1)，取PCR擴增產物4 μl在2.0%瓊脂糖凝膠上進行電泳。

1.2.3 5-aza-dC干預實驗 取對數生長期人結直腸癌細胞株DLD-1、Caco-2，采用0.02% EDTA+0.25%胰酶消化，反復吹打制成單細胞懸液，以每孔2×105個接種于6孔板中，次日更換為含10 μM 5-aza-dC的DMEM培養基，每24 h更換含10 μM 5-aza-dC培養液，以未用10 μM 5-aza-dC處理的細胞作為對照組，96 h后提取細胞總RNA。人結直腸癌細胞株DLD-1、Caco-2的p33ING1b啟動子甲基化檢測和mRNA表達水平檢測方法同上。

2 結果

2.1 p33ING1b啟動子甲基化情況 采用nMSP法成功擴增出癌組織、癌旁組織、痔上黏膜組織甲基化及非甲基化條帶，對PCR產物進行測序證實所擴增片段為目的片段(見圖1)。癌組織p33ING1b啟動子甲基化陽性率為82.5%(52/63)，癌旁組織為34.2%(27/63)，均為不完全甲基化；痔上黏膜組織未檢測出p33ING1b啟動子甲基化(見圖2)。癌組織、癌旁組織、痔上黏膜組織p33ING1b啟動子甲基化陽性率比較，差異有統計學意義(χ2=39.1，P<0.001)；且癌組織p33ING1b啟動子甲基化陽性率高于癌旁組織和痔上黏膜組織，差異均有統計學意義(χ2=21.21，P<0.001；χ2=33.98，P<0.001)。

2.2 p33ING1b啟動子甲基化與患者臨床病理特征的關系 不同性別、年齡、腫瘤位置、分化程度及有無淋巴結轉移、遠處轉移患者癌組織p33ING1b啟動子甲基化陽性率比較，差異均無統計學意義(P>0.05)；不同Dukes分期患者癌組織p33ING1b啟動子甲基化陽性率比較，差異有統計學意義(P<0.05，見表2)。

2.3 p33ING1b啟動子甲基化與癌組織p33ING1b mRNA表達水平的關系 p33ING1b啟動子甲基化癌組織p33ING1b mRNA相對表達量為(0.62±0.15)，低于p33ING1b啟動子非甲基化癌組織的(0.75±0.17)，差異有統計學意義(t=2.553，P<0.05)。

2.4 5-aza-dC干預結果 5-aza-dC干預后，人結直腸癌細胞株DLD-1、Caco-2的p33ING1b啟動子甲基化均被逆轉(見圖3)，兩者p33ING1b mRNA相對表達量較干預前升高，差異均有統計學意義(P<0.05，見表3)。

表2 p33ING1b啟動子甲基化與患者臨床病理特征的關系〔n(%)〕

Table2 Correlation between promoter methylation of p33ING1b and clinical pathology characteristics

例數p33ING1b啟動子甲基化 非甲基化χ2值P值性別00370840 男3630(833)6(167) 女2722(815)5(185)年齡(歲)06770411 ≤583326(788)7(212) >583026(867)4(133)腫瘤位置15920207 結腸2825(893)3(107) 直腸3527(771)8(229)分化程度00010979 高、中分化3730(8008)7(1892) 低分化2622(8462)4(1538)淋巴結轉移10780299 有2623(885)3(115) 無3729(784)8(216)遠處轉移00550814 有 7 6(857) 1(143) 無5646(821)10(179)Ducks分期42420047 A/B期2414(5833)10(4167) C/D期3932(8205) 7(1795)

圖1 巢式-甲基化特異性PCR產物直接測序結果

Table3 Comparison of relative expression of p33ING1b in DLD-1 and Caco-2 cells before and after interference of 5-aza-dC

DLD-1Caco-2干預前 210±029 118±014干預后 400±055 184±034差值-190±062-066±037t值-5258-3061P值 0006 0038

3 討論

Campus等[10]研究表明，p33ING1b與細胞生長增殖抑制、凋亡，腫瘤非依賴性生長、衰老，基因組穩定性維持等存在一定的關聯。既往研究顯示，p33ING1b在人類結直腸癌組織中表達下降，但突變、雜合性缺失非常少見，其表達下降并不是p33ING1b轉錄抑制的主要原因[11-12]。結直腸癌[7]、卵巢癌[9]中p33ING1b存在高甲基化現象，但目前尚無有力證據支持p33ING1b啟動子甲基化為結直腸癌中p33ING1b轉錄抑制的原因。

注：A為甲基化，B為非甲基化；1、2、3、4、5為癌組織，6、7、8、9、10為癌旁組織，11、12、13為痔上黏膜組織，14、15、16分別為陽性對照、陰性對照、空白對照

圖2 癌組織、癌旁組織、痔上黏膜組織p33ING1b啟動子甲基化PCR產物電泳圖

Figure2 Electrophoretogram of p33ING1b PCR products in tumor，adjacent tissue and normal mucosa tissue

注：A為干預前，B為干預后；1、2為人結直腸癌細胞株DLD-1，3、4、5為人結直腸癌細胞株Caco-2，6、7、8分別為陽性對照、陰性對照、空白對照

圖3 5-aza-dC干預前后人結直腸癌細胞株DLD-1、Caco-2的p33ING1b啟動子甲基化情況

Figure3 Condition of promoter methylation of p33ING1b in DLD-1 and Caco-2 cells before or after interference of 5-aza-dC

本研究結果顯示癌組織p33ING1b啟動子甲基化陽性率高于癌旁組織和痔上黏膜組織，提示p33ING1b啟動子甲基化與散發性結直腸癌的發生發展存在關聯。曹云飛等[7]研究顯示，結直腸癌組織p33ING1b啟動子甲基化陽性率為48.33%，本研究為82.5%，存在較大差異，分析其原因可能在于采用的檢測方法不同，曹云飛等[7]采用的是甲基化特異性PCR(MSP)，本研究采用的是nMSP法，而前者的檢測敏感度遠不如nMSP法[13]。本研究對p33ING1b啟動子甲基化與患者臨床病理特征的關系進行分析發現，其與患者性別、年齡、腫瘤位置、分化程度及淋巴結轉移、遠處轉移無關，僅與Dukes分期有關；對p33ING1b啟動子甲基化與癌組織p33ING1b mRNA表達水平的關系進行分析發現，p33ING1b啟動子甲基化癌組織p33ING1b mRNA相對表達量低于p33ING1b啟動子非甲基化癌組織。進一步行5-aza-dC干預實驗發現，5-aza-dC可有效逆轉人結直腸癌細胞株DLD-1、Caco-2的甲基化，并顯著上調p33ING1b mRNA表達水平，提示p33ING1b啟動子甲基化可能是導致p33ING1b基因轉錄抑制的原因。劉麗喬等[14]的研究也表明5-aza-dC對人結腸癌細胞株Caco-2中P16基因啟動子具有去甲基化作用，并可使其mRNA重新表達。

綜上所述，p33ING1b啟動子甲基化與散發性結直腸癌存在關聯，并可能通過抑制p33ING1b mRNA的表達參與結直腸癌的發生和發展；5-aza-dC能有效逆轉人結直腸癌細胞株DLD-1、Caco-2的甲基化，并上調p33ING1b mRNA表達水平，這為結直腸癌的診斷和去甲基化治療提供了一定的實驗依據。

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