脂肪乳對內毒素誘導急性肺損傷大鼠肺組織白介素6分泌及肺泡上皮細胞凋亡的影響

石計朋，黃麗密，尚 云

急性肺損傷(ALI)/急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)指由心源性以外的各種肺內外致病因素導致的急性進行性、缺氧性呼吸衰竭，已成為醫院患者死亡的重要原因之一。雖然抗生素能有效殺滅細菌，但不能阻止已經被激活的全身炎性反應。白介素6(IL-6)是急性炎性反應中的一種多功能細胞因子，具有廣泛的生物活性和免疫調節作用，近年來，其在ALI/ARDS發病過程中的作用一直為學者們所關注。IL-6主要由腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素1β(IL-1β)刺激巨噬細胞分泌，與TNF-α、IL-1β一起被稱作“前炎性細胞因子”。

脂肪乳已普遍應用于危重癥患者的腸外營養，多不飽和脂肪酸(PUFAs)是免疫營養的重要組成部分，可以通過多種分子機制調控機體炎癥和免疫功能，在多種感染疾病的治療中具有良好的前景。目前臨床上常用的脂肪乳有：(1)ω-3魚油脂肪乳注射液(尤文)，屬于ω-3系列，主要有α-亞麻酸、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)等；(2)脂肪乳注射液(C14～24)(英脫利匹特)，屬于ω-6系列，主要包括亞油酸、γ-亞麻酸和花生四烯酸(AA)；(3)長鏈脂肪乳注射液(OO)(克林諾)，含橄欖油80%、豆油20%，特點是富含ω-9單不飽和脂肪酸(ω-9MUFAs)、低飽和脂肪酸、天然抗氧化劑維生素E等。本研究以ALI大鼠為模型，比較英脫利匹特、克林諾和尤文3種脂肪乳對肺組織IL-6分泌及肺泡上皮細胞凋亡的影響，以期為臨床合理使用脂肪乳提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 清潔級幼年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠100只，體質量在160～180 g，由上海斯萊克動物有限責任公司提供，許可證號：SCXK(滬)2003-0003。大鼠于新鄉醫學院實驗動物中心清潔級實驗室內飼養，晝夜照明12 h/12 h，相對濕度70%，飼養溫度25 ℃。

1.1.2 脂肪乳 英脫利匹特和尤文均購自上海華瑞制藥有限公司，克林諾購自美國Baxter公司。

1.1.3 主要試劑和儀器 原位細胞凋亡試劑盒(德國Roche公司)，蘇木素染色液(福州邁新生物技術開發有限公司)，脂多糖(LPS，大腸埃希菌O111：B4，美國Sigma-Aldrich 公司)，總RNA提取試劑(Trizol，上海英駿生物技術有限公司)，反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)試劑盒〔大連寶生物(TaKaRa)公司〕，瓊脂糖(上海生工生物工程有限公司)；LKB-V2088型超薄切片機(瑞典GERMAN)，酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(上海西唐生物科技有限公司)，Wellscan MK3全自動多功能酶標儀(芬蘭Thermo公司)，PCR儀(德國Biometra公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及動物模型制備 將100只SD大鼠按隨機數字表法分為5組，每組20只：對照組、模型組、英脫利匹特組、克林諾組和尤文組。采用靜脈留置針在大鼠尾靜脈穿刺并固定，連續7 d分別向對照組和模型組大鼠注射0.9%氯化鈉注射液(生理鹽水)、英脫利匹特組注射英脫利匹特、克林諾組注射20%克林諾、尤文組注射尤文，劑量均為30 ml·kg-1·d-1。在取血和支氣管肺泡灌洗之前8 h，對照組大鼠氣管內滴入生理鹽水0.25 ml/kg，后4組大鼠均噴灑LPS溶液制備ALI大鼠模型，劑量均為0.5 mg/kg。模型制備成功與否主要根據大鼠有無肺損傷的表現，并通過肺系數和ALI評分來判斷。

1.2.2 標本制備 大鼠氣管內滴入LPS溶液8 h后，將大鼠麻醉，然后打開胸腔。收集肺泡灌洗液(BALF)于EP管中，于-80 ℃保存待行ELISA。左肺：標本離體后，于Eppendorf管內-80 ℃冰箱保存，待測IL-6 mRNA表達水平；右肺：標本置于4%甲醛液中保存，待常規蘇木素-伊紅(HE)染色及脫氧核糖核酸轉移酶介導的細胞凋亡標記技術(TUNEL)檢測。

1.2.3 觀察指標 (1)采用HE染色在光鏡下觀察肺組織上皮細胞的病理變化；(2)RT-PCR法檢測肺組織IL-6 mRNA的表達；(3)采用ELISA法檢測各組BALF中IL-6水平；(4)采用TUNEL檢測細胞凋亡，并計算凋亡指數(apoptosis index，AI)，AI=凋亡細胞數/細胞總數×100%。

2 結果

2.1 ALI大鼠模型制備結果 應用脂肪乳靜脈營養期間，英脫利匹特組、克林諾組和尤文組各死亡2只，對照組死亡1只。氣管內噴灑LPS溶液后，大鼠均出現呼吸急促，精神較差，蜷縮成團，毛發豎起、蓬亂，少數伴有頭部顫動，拒食，2 h左右模型組和英脫利匹特組各死亡3只，克林諾組和尤文組各死亡2只。存活大鼠狀態逐漸好轉，活動可，攝食、飲水，毛發光亮整齊。

各組大鼠光鏡下肺組織的病理變化：除了對照組，其余4組大鼠氣管內噴灑LPS溶液后肺組織均可見明顯的炎性反應。大鼠肺泡結構被破壞；肺泡隔變厚；肺泡腔及間質內可見炎性細胞浸潤；肺泡腔內有較多滲出液，部分肺泡塌陷、不張，甚至有透明膜形成(見圖1)。模型制備后各組大鼠肺系數及ALI評分比較，差異有統計學意義(P<0.05)；其中模型組、英脫利匹特組、克林諾組和尤文組大鼠的肺系數和ALI評分均高于對照組，差異有統計學意義(P<0.01，見表1)，提示ALI大鼠模型建立。

Table1 The lung coefficients and the ALI scores in different groups of rats after LPS treatment

組別只數肺系數ALI評分(分)對照組190.51±0.05 1.56±0.42 模型組170.69±0.09*12.23±2.10*英脫利匹特組150.62±0.10*19.76±0.91*克林諾組160.63±0.09*18.35±0.92*尤文組160.60±0.07*18.89±0.85*F值3.522.93P值0.0180.027

注：ALI=急性肺損傷；與對照組比較，*P<0.01

2.2 各組大鼠肺組織IL-6 mRNA表達水平 5組大鼠肺組織IL-6 mRNA表達水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)；其中對照組大鼠肺組織IL-6 mRNA表達水平均低于其他4組，英脫利匹特組IL-6 mRNA表達水平高于模型組、克林諾組和尤文組，林諾組、尤文組IL-6 mRNA表達水平低于模型組，差異均有統計學意義(P<0.05)；而克林諾組和尤文組間差異無統計學意義(P>0.05，見圖2、表2)。

2.3 各組大鼠BALF中IL-6水平比較 5組大鼠BALF中IL-6水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)；其中對照組大鼠BALF中IL-6水平均低于其他4組，英脫利匹特組IL-6水平高于模型組、克林諾組及尤文組，克林諾組、尤文組IL-6水平低于模型組，差異均有統計學意義(P<0.05)；而克林諾組和尤文組間差異無統計學意義(P>0.05，見表2)。

Table2 Comparison of IL-6 mRNA expression levels of lung tissues and IL-6 levels of BALF in different groups of rats

組別例數IL-6mRNA IL-6(pg/ml)對照組190.023±0.01014.51±3.56 模型組170.214±0.043*58.83±19.18* 英脫利匹特組150.323±0.056*△73.55±14.32*△ 克林諾組160.183±0.020*△▲46.77±9.98*△▲尤文組160.151±0.015*△▲43.76±8.45*△▲F值 2.863.32P值 <0.05<0.05

注：IL-6=白介素6；與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05；與英脫利匹特組比較，▲P<0.05

2.4 各組大鼠肺泡上皮細胞凋亡情況比較 5組大鼠肺組織均可見不同程度的凋亡細胞，凋亡細胞以肺泡上皮細胞為主。各組大鼠肺泡上皮細胞AI比較，差異有統計學意義(P<0.05)；其中對照組AI均低于其他4組，克林諾組、尤文組AI均低于模型組和英脫利匹特組，差異有統計學意義(P<0.05，見表3)。

Table3 Comparison of apoptosis index of alveolar epithelial cells in different groups of rats

組別例數AI 對照組19 3.3±2.0 模型組1719.7±4.9* 英脫利匹特組1518.2±3.0* 克林諾組1612.8±3.9*△▲尤文組1611.8±3.2*△▲F值12.34P值<0.05

注：AI=凋亡指數；與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05；與英脫利匹特組比較，▲P<0.05

注：1為對照組，2為模型組，3為英脫利匹特組，4為克林諾組，5為尤文組

圖1 各組大鼠肺組織HE染色結果(×200)

Figure1 The HE staining of lung tissues in different groups of rats

注：1為對照組，2為模型組，3為英脫利匹特組，4為克林諾組，5為尤文組

圖2 各組大鼠肺組織IL-6 mRNA的表達

Figure2 Expression of IL-6 mRNA of lung tissues in different groups of rats

3 討論

ALI/ARDS的發病機制錯綜復雜，目前認為嚴重創傷和膿毒血癥等引起的過度炎性反應經啟動并失去控制，導致全身炎癥反應綜合征，而肺臟是全身炎性反應失控最容易受到打擊的器官，SIRS失控在肺部表現為ALI/ARDS。在這個過程中，多種效應細胞和炎性遞質參與了ALI/ARDS的發生或發展。IL-6是啟動全身炎性反應最強的內源性炎性遞質，能夠催化和放大炎性反應，是機體炎癥與疾病嚴重程度的重要指標[1]。在參與ALI/ARDS的眾多前炎性細胞因子中，IL-6是ALI/ARDS發生、發展中起重要作用的炎性遞質。Hierholzer等[2]給正常小鼠氣管內吸入IL-6可導致多形核白細胞(PMN)滲透、積聚以及以肺水腫為特征的ALI，認為IL-6可致肺損傷。其轉錄由核因子κB(NF-κB)所介導，而NF-κB可被活性氧等上游信號分子誘導活化，從而激活IL-6信號途徑。LPS預處理后，年輕和衰老小鼠腹腔巨噬細胞分泌IL-6的能力普遍增加[3]。

英脫利匹特是在臨床上最常使用的富含ω-6長鏈PUFAs，以豆油為主要來源，其中亞油酸被分解產生的AA是脂質炎性遞質的前體，通過環氧化酶、脂氧化酶、細胞色素-P450途徑可以產生多種炎性遞質，如前列腺素E2、白三烯B4(LTB4)等，進而調節炎性反應和免疫。在歐洲國家，一種富含ω-9MUFAs、以橄欖油為主的脂肪乳——克林諾，被推薦用于靜脈營養(含橄欖油80%、豆油20%)。此外，一種富含ω-3PUFAs、以魚油為主的脂肪乳——尤文，對炎癥的影響也是最近比較熱門的研究課題，其主要成分為EPA和DHA，二者可增加細胞膜磷脂ω-3PUFAs成分，減少炎性二十烷類產生；同時增加了非炎性二十烷，以競爭AA至二十烷類合成的途徑，從而調節機體內一系列細胞因子的水平及免疫功能。

ω-3PUFAs在脂氧合酶和環氧合酶的作用下產生前列腺素3(PGE3)和白三烯B5(LTB5)，對中性粒細胞的趨化、聚集和釋放溶菌酶等的作用大約是LTB4的十分之一；同時ω-3PUFAs與AA競爭結合細胞膜磷脂，降低細胞膜磷脂中AA含量，進而減少高效炎性遞質的產生；ω-3PUFA還可通過抑制磷脂酶A2(PLA2)的活性，減少膜磷脂AA的釋放，從而減少來源于AA的類花生酸；EPA和DHA還能抑制細菌LPS誘導NF-κB的活化和環氧酶2的表達[4]。本研究結果顯示，英脫利匹特的代謝產物AA作為脂質炎性遞質的前體，可顯著上調肺組織IL-6 mRNA的表達，使BALF中IL-6水平升高；而克林諾組和尤文組肺組織IL-6 mRNA的表達和BALF中IL-6水平則較英脫利匹特組降低。由于克林諾富含天然抗氧化劑維生素E，后者能夠減少氧自由基和脂質過氧化物的損害；而NF-κB可被活性氧等上游信號分子誘導活化，從而激活IL-6信號途徑。通過研究推測克林諾可能通過減少NF-κB的活化而下調IL-6的表達。尤文能降低IL-6的表達，推測其機制可能與其主要成分EPA和DHA減少炎性遞質的產生，并能抑制細菌LPS誘導NF-κB的活化有關。在降低炎性遞質IL-6分泌方面，克林諾與尤文作用相似，均優于豆油來源的英脫利匹特。

細胞凋亡又稱為程序性細胞死亡，指體內外生理或病理因素觸發細胞內預存的死亡程序而導致的細胞主動死亡過程，在炎癥、損傷、組織修復等過程中具有重要的作用。研究發現，活性氧[5]、LPS[6]均可誘導肺泡上皮細胞的主要組成細胞——肺泡Ⅱ上皮細胞(AT-Ⅱ)的凋亡。英脫利匹特所引起高氧化狀態致使氧自由基大量增加和脂質過氧化加重，從而影響細胞黏附，介導細胞凋亡。故本研究發現英脫利匹特組大鼠肺泡上皮細胞凋亡增加。克林諾所含PUFAs較少，脂質過氧化反應小，故可通過減少氧自由基及脂質過氧化物的生成而降低肺泡上皮細胞的凋亡。尤文也能通過抑制氧自由基形成和脂質過氧化來減少細胞凋亡[7]。有文獻報道，克林諾和尤文都能通過降低炎性遞質而減少肺泡上皮細胞凋亡[8]。在本實驗中，英脫利匹特對肺泡上皮細胞的凋亡有促進作用，而克林諾和尤文則能減少細胞凋亡。

以往對脂肪乳的研究多集中于細胞培養方面，本實驗是在活體大鼠內進行的，與以往實驗相比，對臨床工作更有參考價值。今后可進一步研究3種脂肪乳對LPS所致肺損傷的影響，以探討其對炎性遞質的深層調節機制。

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2 Hierholzer C，Kalff JC，Omert L，et al.Interleukin-6 production in hemorrhagic shock is accompanied by neutrophil recruitment and lung injury[J].Am J Physiol，1998，275(3 Pt 1)：L611-621.

3 黃智云，宋琳.脂多糖體內外誘導年輕和衰老小鼠腹腔巨噬細胞表達IL-6的差異研究[J].國際免疫學雜志，2011，34(6)：393-396.

4 Lee JY，Plakidas A，Lee WH.Differential modulation of Toll-like receptors by fatty acids：preferential inhibition by n-3 polyunsaturated fatty acids[J].J Lipid Res，2003，44(3)：479-486.

5 Husari AW，Dbaibo GS，Bitar H，et al.Apoptosis and the activity of ceramide，Bax and Bcl-2 in the lungs of neonatal rats exposed to limited and prolonged hyperoxia[J].Respir Res，2006(7)：100.

6 宋勇，施毅，Alden HH，等.內毒素誘導小鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞凋亡不依賴TNF-α的研究[J].醫學研究生學報，2003，16(6)：420-423.

7 Li YH，Chen M，Brauner A，et al.Ureaplasma urealyticum induces apoptosis in human lung epithelial cells and macrophages[J].Biol Neonate，2002，82(3)：166-173.

8 Glatzle J，Beckert S，Kasparek MS，et al.Olive oil is more potent than fish oil to reduce septic pulmonary dysfunctions in rats[J].Langenbecks Arch Surg，2007，392(3)：323-329.