星形膠質細胞上調基因1和基質金屬蛋白酶9在人腦膠質瘤中的表達及其相關性研究

吳建珩，李曉輝，單 嶠，李培棟

腦膠質瘤細胞的侵襲性增長包括細胞黏附、運動及細胞外基質(extracellular matrix,ECM)降解等諸多過程，所涉及的分子機制十分復雜。星形膠質細胞上調基因1 (astrocyte elevated gene-1，AEG-1)是2002年用改良的快速減數雜交(rapid subtraction hybridization，RaSH)法首次發現1型人類免疫缺陷病毒(HIV-1)感染后星形膠質細胞中表達增高的新基因，該區域也是與人類腦膠質瘤發生高度相關的地帶[1]。近些年研究表明，AEG-1與胃癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌等腫瘤的發生發展密切相關，能夠促進腫瘤的侵襲和轉移[2]。基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)是ECM降解過程中最重要的一類酶，其中MMP-9與腦膠質瘤的侵襲性生長密切相關。目前，國內外對AEG-1和MMP-9在腦膠質瘤中的表達及作用的研究報道較少。本研究通過反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)和Western blotting檢測AEG-1與MMP-9在不同級別腦膠質瘤組織中的表達情況，分析兩者的相關性，并探討其與腦膠質瘤病理分級的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2009年5月—2012年6月鄭州大學第五附屬醫院住院的具有明確病理分級的腦膠質瘤標本72例為腦膠質瘤組，患者術前均未行放化療。按照《2007年WHO中樞神經系統腫瘤組織學分類》[3]標準分級，其中低級別組(Ⅰ～Ⅱ級)32例，男17例、女15例，年齡31～85歲，平均(58.7±5.9)歲；高級別組(Ⅲ～Ⅳ級)40例，男22例、女18例，年齡33～87歲，平均(60.2±6.7)歲。另收集腦創傷行內減壓去除的腦組織36例作為對照組。每份標本都分為2份，一份經10%福爾馬林固定，另一份取下后立即用液氮冷凍保存。

1.2 RT-PCR 采用Primer premier 6.0軟件設計引物，由上海生工生物工程有限公司合成，AEG-1上游引物：5′-GGCAATTGGGTAGACGAAGA-3′，下游引物：5′-TTGAATTTGGAGGGATCTCG-3′，引物長度426 bp；MMP-9上游引物：5′-TTCCCTGGAGACCTGAGAACC-3′，下游引物：5′-CGACACCAAACTGGATGACGC-3′，引物長度：339 bp；β-actin上游引物：5′-AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC-3′，下游引物：5′-CTGGGACGACATGGAGAAAA-3′，引物長度：150 bp。應用RT-PCR試劑盒(上海生工生物工程有限公司)按照說明書完成試驗。反應產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，應用美國Eagle EyeⅡ型凝膠圖像軟件測定目的基因的吸光度值。

1.3 Western blotting 裂解組織提取蛋白，BCA法進行蛋白定量。AEG-1、MMP-9蛋白分別于10%、7%聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后，轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%的脫脂牛奶室溫封閉1 h，分別加入一抗(Santa公司)兔抗人AEG-1和MMP-9抗體(均為1∶500)孵育，4 ℃過夜。洗膜后分別加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗(1∶2 000，Santa公司)，室溫孵育1 h，增強化學發光法(ECL)轉至X光膠片。采用美國Eagle EyeⅡ型凝膠圖像分析系統測定目標蛋白和標準對照的吸光度，取兩者比值作為目標蛋白半定量相對值。

2 結果

2.1 AEG-1的表達 與對照組比較，低級別組和高級別組AEG-1 mRNA及蛋白表達水平上調，差異有統計學意義(P<0.05)；與低級別組比較，高級別組AEG-1 mRNA及蛋白表達水平上調，差異有統計學意義(P<0.05，見表1、圖1和圖2)。

2.2 MMP-9的表達 與對照組比較，低級別組和高級別組MMP-9 mRNA及蛋白表達水平上調，差異有統計學意義(P<0.05)；與低級別組比較，高級別組MMP-9 mRNA及蛋白表達水平上調，差異有統計學意義(P<0.05，見表2、圖3和圖4)。

Table1 Comparison of mRNA and protein expression levels of AEG-1 between human glioma group and control group

組別例數AEG-1/β-actinmRNAAEG-1/β-actin蛋白對照組360.204±0.078 0.309±0.074 低級別組320.523±0.116* 0.556±0.108* 高級別組400.817±0.142*△0.790±0.155*△F值67.82542.013P值 0.000 0.000

注：AEG-1=星形膠質細胞上調基因1；與對照組比較，*P<0.05；與低級別組比較，△P<0.05

注：AEG-1=星形膠質細胞上調基因1

圖1 RT-PCR檢測AEG-1 mRNA表達水平

Figure1 The expression level of AEG-1 mRNA detected by RT-PCR

圖2 Western blotting檢測AEG-1蛋白表達水平

Figure2 The expression level of AEG-1 protein detected by Western blotting

Table2 腦膠質瘤組與對照組MMP-9 mRNA及蛋白表達水平比較

Table2 Comparison of mRNA and protein expression levels of MMP-9 between human glioma group and control group

組別例數MMP-9/β-actinmRNAMMP-9/β-actin蛋白質對照組360.229±0.086 0.152±0.039 低級別組320.458±0.103* 0.298±0.088* 高級別組400.776±0.128*△0.651±0.117*△F值56.95249.376P值 0.000 0.000

注：MMP-9=基質金屬蛋白酶9；與對照組比較，*P<0.05；與低級別組比較，△P<0.05

注：MMP-9=基質金屬蛋白酶9

圖3 RT-PCR檢測MMP-9 mRNA表達水平

Figure3 The expression level of MMP-9 mRNA detected by RT-PCR

圖4 Western blotting檢測MMP-9蛋白表達水平

Figure4 The expression level of MMP-9 protein detected by Western blotting

2.3 MMP-9與AEG-1表達的相關性 Spearman相關分析顯示，MMP-9與AEG-1表達呈正相關(r=0.693，P<0.01,見圖5)。

3 討論

腦膠質瘤是中樞神經系統最常見的惡性腫瘤，其發生是相關基因共同參與、相互作用的結果。AEG-1是近年發現的新基因，位于8q22，由12個外顯子和11個內含子組成，其編碼蛋白的異常表達可以通過多種信號途徑調節細胞的致癌性轉化,提高腫瘤細胞的增殖和抗凋亡能力,增加腫瘤細胞的侵襲和轉移,加速腫瘤新生血管生成[4]。Jeon等[5]于2009 年進一步證實AEG-1是一種新的癌基因。本研究發現，無論在基因水平還是蛋白水平，腦膠質瘤內AEG-1的表達均高于對照組，

圖5 MMP-9與AEG-1表達水平的相關性

這與Yang等[6]的研究結果一致，提示AEG-1在腦膠質瘤的發生過程中起重要作用。本研究結果還顯示，AEG-1基因和蛋白在高級別腦膠質瘤中的表達高于在低級別腦膠質瘤中的表達。可見，腦膠質瘤的惡性程度越高，AEG-1表達就越高，提示AEG-1在腦膠質瘤的進展過程中起重要的促進作用。AEG-1可激活PI3K/Akt信號通路，調節PI3K/Akt信號通路的下游基因P53、FOXO1、FOXO3a、AP-1等轉錄因子的表達，從而介導腦膠質瘤細胞的異常增殖和抗凋亡能力。此外，Lee等[7]研究表明，AEG-1激活PI3K/Akt信號途徑還可以誘導轉錄因子——低氧誘導因子1(HIF1)的表達，后者能夠增加血管內皮生長因子(VEGF)的轉錄水平，從而導致腦膠質瘤內血管生成增多。Emdad等[8]發現RNA干擾(RNAi)沉默AEG-1基因后能夠降低腦膠質瘤細胞的侵襲和轉移能力。雖然AEG-1促進腦膠質瘤生長、侵襲及轉移的具體機制尚不明了，但AEG-1仍可作為一項有意義的評估腦膠質瘤惡性程度的指標。

MMPs是一類Zn2+依賴性蛋白酶，與腫瘤的浸潤和轉移密切相關，MMP-9是MMPs中分子量最大且最重要的酶，可以降解ECM中的多種蛋白成分，能夠破壞防止腫瘤細胞侵襲的組織學屏障，從而造成腫瘤細胞的侵襲和轉移[9-10]。本研究發現MMP-9 mRNA及蛋白在腦膠質瘤中的表達顯著高于在正常腦組織中的表達，而且MMP-9在高級別級腦膠質瘤中的表達顯著高于在低級別腦膠質瘤中的表達，這與Ponnala等[11]的研究結果一致。在腦膠質瘤發生發展過程中，MMP-9通過降解腦膠質瘤ECM為腫瘤向正常腦組織侵襲提供通路和空間，對腦膠質瘤的侵襲性生長具有重要意義。研究發現，具有侵襲能力的腦膠質瘤細胞能夠分泌大量的MMP-9，同時其侵襲力與MMP-9的表達水平密切相關[12]。

本研究發現，MMP-9在腦膠質瘤中的表達與AEG-1的表達呈正相關，說明AEG-1能夠通過調控MMP-9的表達而促進腦膠質瘤細胞的增殖和轉移。Liu等[13]研究表明，AEG-1能夠通過增強MMP-9的表達而促進腦膠質瘤的侵襲和進展。最近研究表明，采用RNAi技術下調腦膠質瘤中AEG-1 mRNA的表達后，MMP-9的表達也顯著下調[14]。AEG-1能夠激活核因子кB(NF-кB)分子通路，而MMP-9是NF-кB的下游基因，其表達受NF-кB的調控，由此推測，AEG-1可能通過NF-кB信號通路調控MMP-9的表達。這些研究結果提示兩者具有協同促進腦膠質瘤侵襲的作用，從而為進一步闡明二者在腦膠質瘤中的相互調控關系提供了可靠的理論依據。

總之，AEG-1和MMP-9參與了腦膠質瘤的增殖和侵襲，腦膠質瘤的病理分級越高，惡性程度越高，AEG-1和MMP-9的表達就越高，且二者的表達具有相關性。AEG-1和MMP-9協同促進腦膠質瘤的增殖和侵襲，但二者在腦膠質瘤中具體相互作用機制尚待進一步研究，這將是下一階段研究的重點。本研究豐富了人們對腦膠質瘤基因治療的探索，為腦膠質瘤的分子治療提供了新的靶點和理論基礎。

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