血糖波動和降鈣素基因相關肽對糖尿病大鼠腎臟病變的影響

王亞嬌，蘇 珂，龍 艷，康 省，于 健，胡 璟，黃漓莉，江仁美

本研究重點

由于飲食控制、服藥依從性差、用藥不合理等多種因素的影響，臨床上糖尿病患者血糖波動較大，降鈣素基因相關肽是已知舒血管作用最強的多肽。本研究通過建立糖尿病血糖波動模型，從病理、分子方面分析血糖波動和降鈣素基因相關肽對糖尿病腎病的影響，為揭示糖尿病腎病的病因等提供理論依據。

糖尿病的主要危害在于長期慢性的高血糖以及其他代謝紊亂導致全身多種組織器官的損傷和功能異常。慢性高血糖主要表現為慢性持續性高血糖和慢性波動性高血糖，由于受飲食控制不佳、用藥不合理、胰島素抵抗等多種因素的影響，臨床上糖尿病患者的血糖波動較大[1],研究發現波動性高血糖比持續性高血糖危害更大[2]。降鈣素基因相關肽(CGRP)是一種目前已知的最強的內源性舒血管多肽，通過抑制腎血管細胞收縮，增加腎小球毛細血管超濾系數，改善腎臟微循環，對腎臟有保護作用[3]。本研究通過建立波動性高血糖糖尿病大鼠模型，觀察比較血糖波動、CGRP與腎功能、腎臟病理之間的關系，探討其與糖尿病腎病(DN)之間的關系。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級健康雄性SD大鼠40只，體質量150～200 g，6～8周齡〔桂林醫學院SPF級實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(桂)2007-0001〕；鏈脲佐菌素(STZ)及枸櫞酸鈉分析純(Sigma公司)；普通胰島素10 ml∶400 U(通化東寶藥業股份有限公司)；羅氏卓越型血糖儀及配套試紙(瑞士羅氏公司)；CGRP試劑盒(武漢華美生物工程有限公司)；其他試劑及材料均購自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法 40只大鼠按照隨機數字表法各取8只作為正常對照組(A組)和正常血糖波動組(B組)，其余大鼠按60 mg/kg劑量左下腹腔注射STZ，72 h后取尾血測血糖，凡血糖≥16.7 mmol/L的大鼠定為糖尿病模型。符合糖尿病條件的大鼠按照隨機數字表法分為糖尿病穩定高血糖組(C組)和糖尿病血糖波動組(D組)，每組各8只。糖尿病造模成功后D組每天8:30和14:30腹部皮下注射普通胰島素1～2 U，B組和D組每日8:00和14:00灌葡萄糖2 g/kg，2.0 ml/次，造成血糖波動模型，A組和C組按以上的時間和方法灌0.9%氯化鈉溶液2.0 ml，連續9周。所有大鼠自由飲水，喂食正常飼料。

1.3 觀察指標

1.3.1 一般情況 精神、活動、毛發、飲食等。

1.3.2 生化指標檢測 采用羅氏卓越型血糖儀及配套試紙連續9周每周進行一次全天7個時間點的血糖檢測，時間分別是8:00、8:30、10:00、14:00、14:30、16:00、20:00。計算每組大鼠平均血糖(MBG)水平，每日血糖水平標準差(SDBG)反映血糖的穩定性，最大血糖波動幅度(LAGE)即日內血糖最高值與最低值之差。造模9周后，留24 h尿測24 h尿微量清蛋白，禁食12 h，以10%水合氯醛腹腔麻醉，心內取血測血尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、糖化血紅蛋白(HbA1c)水平。

1.3.3 血清CGRP測定 心內取血離心后得血清，采用酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測血清CGRP水平。

1.3.4 病理標本取材 取左腎，濾紙吸干血跡后電子天平稱重得腎濕質量，腎濕質量與體質量的比為腎指數(KI)，KI(g/kg)=左腎質量/體質量，部分腎臟組織用4%多聚甲醛液固定，石蠟包埋，常規切片蘇木素-伊紅(HE)染色，顯微鏡觀察腎臟形態學的改變并拍照。

2 結果

2.1 4組大鼠體質量、KI、MBG、SDBG、LAGE比較 實驗結束后C組和D組與A組比較，大鼠出現精神狀態萎靡，毛發豎起粗糙無光澤，動作反應遲鈍，弓背蜷縮，飲水量、飲食量、尿量增加。C組和D組大鼠體質量、KI、MBG、SDBG、LAGE與A組和B組比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；D組大鼠KI、MBG、SDBG、LAGE與C組比較，差異均有統計學意義(P<0.05，見表1)。

2.2 4組大鼠24 h尿微量清蛋白、BUN、Cr、HbA1c、CGRP比較 C組和D組大鼠24 h尿微量清蛋白、BUN、Cr、HbA1c、CGRP與A組和B組比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；D組大鼠24 h尿微量清蛋白、BUN、Cr、CGRP與C組比較，差異均有統計學意義(P<0.05，見表2)。

2.3 相關性分析 Pearson相關性分析結果顯示，SDBG與24 h尿微量清蛋白(r=0.927，P<0.01)、BUN(r=0.883，P<0.01)、Cr(r=0.825，P<0.01)呈正相關,與CGRP呈負相關(r=-0.823，P<0.01)；CGRP與24 h尿微量清蛋白(r=-0.878，P<0.01)、BUN(r=-0.792，P<0.01)、Cr(r=-0.796，P<0.01)呈負相關。

2.4 光鏡下大鼠腎臟結構的改變 光鏡下見：A組和B組的腎小球和腎小管結構未見明顯改變。C組和D組較A組出現腎小球囊腔擴張，腎小球細胞減少，炎性細胞浸潤，腎小管結構紊亂，上述變化D組較C組嚴重(見圖1)。

3 討論

DN是糖尿病最常見的慢性并發癥之一，其發生是由于遺傳、環境、糖代謝紊亂等多種因素長期共同作用的結果，超過30%發展為終末期腎病。Muggeo等[2]對2型糖尿病患者進行了10年的隨訪，發現血糖變異>18.7%和<11.7%者累計病死率分別為39.6%和23.7%，校正后血糖變異幅度大者發生死亡的相對危險度為1.68，說明血糖波動大的患者病死率比單純性高血糖高。一項臨床研究顯示HbA1c控制在<6.5%情況下，血糖波動大的2型糖尿病患者更易于誘發糖尿病微量蛋白尿的發生[4]。體外基礎研究及血糖波動動物模型研究均表明，波動性高血糖比持續性高血糖更易促進腎小管上皮細胞凋亡，氧化應激水平增高[5]；使腎小球系膜細胞膠原Ⅳ合成增加[6]，加速內皮細胞依賴性舒張損傷[7]，加速腎小管間質纖維化的進程[8]等，以上研究說明血糖波動比單純性高血糖危害性更大。本研究顯示實驗結束后D組大鼠的體質量、HbA1c與C組無差異，通過量化分析血糖穩定性顯示D組的SDBG、LAGE均高于C組，而MBG低于C組，說明D組的日間血糖穩定性差，日間血糖波動幅度大，而C組基本處于相對穩定的高水平狀態，A組和B組則在參考范圍。以上結果說明糖尿病大鼠血糖波動模型造模成功。本研究顯示D組和C組24 h尿微量清蛋白、BUN、Cr明顯高于A組，D組高于C組。光鏡下腎結構見D組較C組出現明顯的腎小球囊腔擴張，腎小球細胞減少，炎性細胞浸潤，腎小管結構紊亂。相關分析顯示SDBG與24 h尿微量清蛋白、BUN、Cr呈正相關，以上研究結果說明血糖波動對糖尿病腎臟的損害比持續性高血糖更明顯，提示血糖波動可能是DN的獨立危險因素，本研究結果與相關報道[4]相似。國內外相關的研究認為波動性高血糖可能易通過不同的代謝途徑激活如核因子κB、谷胱甘肽過氧化物酶、自由基、線粒體超氧陰離子等多種氧化應激敏感細胞因子，產生過多的活性氧誘導細胞線粒體內氧化應激反應，同時形成晚期糖基化終產物并沉積，進而啟動或調節一些炎性因子、黏附分子等轉錄，直接或通過一系列的氧化鏈式反應引起血管內皮損傷，血管收縮，最終造成血管炎癥、血栓形成、血管基底膜增厚、血管硬化等，加速了DN的發生發展[5-7，9-11]。

Table1 Comparison of weight,KI,MBG,SDBG and LAGE in the four groups

組別例數體質量(g)KI(g/kg)MBG(mmol/L)SDBG(mmol/L)LAGE(mmol/L)A組8435±34 3.45±0.31 6.37±0.64 0.55±0.28 1.45±0.67 B組8428±41 3.56±0.29 6.41±0.79 0.68±0.36 1.88±1.15 C組8336±35*△4.67±0.23*△ 24.45±4.13*△ 3.56±1.16*△ 9.89±2.69*△ D組8320±34*△5.26±0.22*△▲20.91±8.67*△▲8.98±1.15*△▲22.17±2.69*△▲F值21.92088.3261956.7331558.1551137.459P值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

注：KI=腎指數，MBG=平均血糖，SDBG=每日血糖水平標準差，LAGE=最大血糖波動幅度；與A組比較，*P<0.05；與B組比較，△P<0.05；與C組比較，▲P<0.05

表2 4組大鼠24 h尿微量清蛋白、BUN、Cr、HbA1c、CGRP比較

注：BUN=尿素氮，Cr=肌酐，HbA1c=糖化血紅蛋白，CGRP=降鈣素基因相關肽；與A組比較，*P<0.05；與B組比較，△P<0.05；與C組比較，▲P<0.05

圖1 4組大鼠腎臟形態學變化(HE染色,×400)

腎臟的血管床有豐富的CGRP受體分布，CGRP通過與這些受體結合使腎血管舒張、拮抗內皮素對血管收縮、抑制血管平滑肌細胞的增殖等，從而增加腎小球濾過率和有效血容量，參與腎臟血流動力學的變化，對腎臟有很好的保護作用[3]。本研究結果顯示D組和C組的CGRP水平低于A組，相關分析顯示CGRP和24 h尿微量清蛋白、BUN、Cr之間呈負相關，說明CGRP與DN相關，同時提示CGRP可能作為DN的早期預測因素，與相關報道[12]相似。本研究顯示D組的CGRP水平較C組降低，SDBG與CGRP呈負相關，提示血糖波動可能是CGRP的影響因素。已有研究報道體外培養人臍靜脈內皮細胞，波動性高血糖組內皮素合成明顯高于持續高血糖組[13]，內皮素增多可使血管內皮細胞損傷，導致組織缺血缺氧，使CGRP免疫反應纖維減少，CGRP釋放隨之減少，這可能是血糖波動組比持續高血糖組CGRP水平降低明顯的原因之一[13]。CGRP降低使其對腎臟的保護功能減弱，當循環中的CGRP顯著減少時內皮素的作用也相應增強，內皮素可引起周圍的血管長時間收縮，加重組織缺血缺氧和血管內皮損傷等一系列病理過程，而缺血缺氧又可促進內皮素的合成，進一步拮抗了CGRP的作用，形成了惡性循環，引起微血栓形成、血管平滑肌細胞增殖、血管內皮細胞損傷等，最終導致腎功能受損，促進了DN的發生發展[3]。

綜上所述，血糖波動與CGRP的降低可能共同參與了DN發生發展過程，臨床上應減少血糖波動范圍，平穩降糖，動態觀察CGRP的變化，對DN的防治有重要的意義。

本課題人員貢獻：蘇珂負責課題設計、組織實施、質控；龍艷、于健、胡璟負責分子生物學實驗操作；王亞嬌、康省、黃漓莉、江仁美負責動物模型構建、統計分析。

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