S-亞硝基-N-乙酰半胱氨酸對綠膿菌素感染鼠體內的病理形態及氧化作用的影響

劉 偉，柴文戍

銅綠假單胞菌是機體免疫力低下者急性院內感染的重要原因，也是肺纖維化或支氣管擴張患者慢性或反復肺感染的最常見原因[1]。綠膿菌素(PCN)是銅綠假單胞菌產生的毒力因子，對哺乳類細胞有很多破壞性作用。研究證明了PCN通過產生活性氧(ROS)對內皮細胞[2]和上皮細胞[3]產生氧化損傷作用。一氧化氮(NO)是哺乳類動物宿主防御的重要成分，是獨特的抗菌劑，NO抑制各種微生物的生長，包括病毒、細菌、寄生蟲和真菌[4]。NO衍生的活性分子，如過氧亞硝基(ONOO-)，可以誘導病原體氧化損傷。研究證明NO在缺血再灌注損傷時能夠防止氧化損傷，并減少哺乳動物宿主細胞的氧化壓力[5]。S-亞硝基-N-乙酰半胱氨酸(SNAC)是NO供體，可以改善細胞氧化損傷。本實驗主要探索PCN對感染鼠體內ROS、超氧化物歧化酶(SOD)、白介素8(IL-8)的作用及其機制，進一步探討SNAC對此作用的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 PCN購買于Sigma公司。實驗所用動物均為無病原體的8～12周齡、體質量230～250 g的健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(遼寧醫學院動物實驗中心提供)。試劑盒購自南京建成生物工程研究所，N-乙酰半胱氨酸(NAC)與亞硝酸鈉(NaNO2)購買于生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制備及分組 采用隨機數字表法將90只健康雄性SD大鼠分為對照組、PCN組和SNAC組，每組30只。對照組和PCN組大鼠分別腹腔注射1 ml/100 g 0.9%氯化鈉溶液，SNAC組大鼠腹腔注射SNAC(1 ml/100 g)。用1%戊巴比妥鈉溶液(40 mg/kg)行大鼠腹腔注射麻醉，對照組氣管內接種0.9%氯化鈉溶液0.2 ml，PCN組和SNAC組分別氣管內接種PCN 0.2 ml(6×108CFU/ml)。

1.2.2 SNAC準備 NAC和NaNO2用于SNAC準備[6]。由等摩爾的NAC和NaNO2混合生成SNAC水溶液，室溫條件下避光混合攪拌20 min。0.9%氯化鈉溶液稀釋SNAC到終濃度100 nmol/L并立即使用。

1.2.3 病理標本取材及處理 分別于PCN感染后6、18、30、48、72 h，用1%戊巴比妥鈉溶液(40 mg/kg)進行腹腔麻醉,處死大鼠。然后分離氣管,經氣管注入5 ml無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)行右側支氣管肺泡灌洗,反復5次,回收后注入無菌試管,回收率≥80%。回收的支氣管肺泡灌洗液(BALF)離心(離心半徑 13.5 cm,2 000 r/min，10 min),取上清液保存于-20 ℃,統一進行BALF細胞總數和中性粒細胞計數。取左上肺浸泡于10%甲醛溶液中,做蘇木素-伊紅(HE)染色；取左肺余肺1 g加入9 ml 0.86%冷氯化鈉溶液制成肺組織勻漿,離心,取上清液保存于-70 ℃，統一進行生化指標測定。

1.2.4 大體觀察 分別于PCN感染后6、18、30、48、72 h觀察大鼠精神狀態、進食及飲水情況及肺炎癥狀，并觀察肺組織外觀顏色、水腫、出血等炎性表現及鏡下觀察相應時間點肺臟病理組織形態學變化。

1.2.5 肺組織ROS含量、SOD活性的測定 肺組織勻漿ROS含量及SOD活性測定按試劑盒說明書操作步驟進行。

1.2.6 肺組織IL-8含量的測定 使用酶聯免疫吸附法(ELISA)測定肺組織勻漿IL-8含量，按試劑盒說明書操作步驟進行。

2 結果

2.1 大鼠的一般狀態及肺組織外觀 PCN感染6 h后大鼠出現精神萎靡、食欲不振、寒顫、發熱、呼吸困難，感染30 h最明顯。對照組大鼠肺外觀呈粉紅色，無明顯異常改變；PCN組PCN感染后6 h時可見肺組織表面散在點狀出血；18～72 h肺體積增大，肺組織暗紅色，呈片狀出血；SNAC組肺組織病變較PCN組明顯減輕。

2.2 肺組織形態學變化 光鏡下可見對照組肺組織結構清晰，肺泡間隔無增厚及炎性細胞浸潤；PCN組肺組織肺泡壁結構完整性被破壞，肺泡間隔增厚，明顯充血、水腫，肺泡內大量炎性細胞浸潤，30 h出現典型肺炎表現；與PCN組相比，SNAC組肺組織炎性表現明顯減輕，肺泡壁結構完整性較好，充血、水腫減輕，炎性細胞浸潤減少(見圖1)。

2.3 3組大鼠不同時間BALF細胞總數及中性粒細胞計數比較 3組大鼠PCN感染后6、18、30、48、72 h BALF細胞總數及中性粒細胞計數比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；其中PCN組和SNAC組各時間點BALF細胞總數及中性粒細胞計數較對照組均增高，SNAC組各時間點BALF細胞總數及中性粒細胞計數較PCN組均降低，差異有統計學意義(P<0.05，見表1、2)。

2.4 3組大鼠不同時間ROS含量比較 3組大鼠PCN感染后6、18、30、48、72 h ROS含量比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；其中PCN組和SNAC組各時間點ROS含量較對照組均增高，SNAC組各時間點ROS含量較PCN組均降低，差異有統計學意義(P<0.05，見表3)。

2.5 3組大鼠不同時間SOD活性比較 3組大鼠PCN感染后6、18、30、48、72 h SOD活性比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；其中PCN組和SNAC組各時間點SOD活性較對照組均降低，SNAC組各時間點SOD活性較PCN組均增高，差異有統計學意義(P<0.05，見表4)。

2.6 3組大鼠不同時間IL-8含量比較 3組大鼠PCN感染后6、18、30、48、72 h IL-8含量比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；其中PCN組和SNAC組各時間點IL-8含量較對照組均增高，SNAC組各時間點IL-8含量較PCN組均降低，差異有統計學意義(P<0.05，見表5)。

注：a對照組肺組織結構清晰，肺泡間隔無增厚及炎性細胞浸潤；b PCN組肺泡壁結構完整性被破壞，肺泡間隔增厚，明顯充血、水腫，肺泡內大量炎性細胞浸潤；c SNAC組肺組織炎性表現減輕，肺泡壁結構完整性好，充血、水腫減輕，炎性細胞浸潤減少

圖1 PCN感染后30 h肺組織形態學變化(HE染色，×200)

注：與對照組比較，*P<0.05；與PCN組比較，△P<0.05

表2 3組大鼠不同時間BALF中性粒細胞計數比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與PCN組比較，△P<0.05

表3 3組大鼠不同時間ROS含量比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與PCN組比較，△P<0.05

表4 3組大鼠不同時間SOD活性比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與PCN組比較，△P<0.05

表5 3組大鼠不同時間IL-8含量比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與PCN組比較，△P<0.05

3 討論

本研究結果表明PCN感染后，PCN組肺組織明顯充血、水腫，大量炎性細胞浸潤，BALF檢測到炎性細胞顯著增加，以中性粒細胞為主，ROS含量增高，SOD活性降低，IL-8含量增加，說明PCN發揮毒性作用與氧化損傷有關。而SNAC干預后，SNAC組大鼠一般狀態較好，肺組織炎性表現減輕，BALF檢測到的炎性細胞明顯減少，ROS含量減少，SOD活性增加，IL-8含量減少，表明SNAC對小鼠體內的PCN氧化損傷具有保護作用。研究還表明大鼠的一般狀態、肺組織病理炎性表現在PCN感染后30 h時表現最明顯。

上述表現其原因考慮為，SNAC是NO供體，NO不僅具有免疫調節作用而且直接作用于微生物，NO既可以殺死病原體又可以抑制其復制。許多機制參與氮氧化物的抗菌作用，包括改變蛋白質硫醇和金屬中心的相互作用[7-8]，阻塞微生物基本生理過程[9-10]，破壞細菌的蛋白質鐵硫集群而導致催化毒性氧化反應的游離鐵的釋放[11]。NO和相關物質通過擾亂參與DNA復制的鋅蛋白和與酪氨酰激酶反應抑制核苷酸還原酶，進而抑制細菌DNA復制[12]。此外，線粒體是ROS的重要來源，其損傷可能導致細胞氧化損傷，SNAC能改善線粒體的功能，因此導致ROS產生減少[6]，發揮其保護氧化損傷的作用。而且有報道認為在假單胞菌肺炎動物模型中，吸入NO可以減少細菌的負荷[13]。本實驗結果表明PCN通過氧化應激導致細胞核組織損傷。SNAC作為NO供體，不僅具有抗菌作用，而且對氧化損傷具有一定的保護作用。

研究表明PCN主要通過介導ROS的產生造成氧化應激而發揮其毒性作用，PCN可以被NAD(P)H 或硫醇直接還原，通過有氧氧化循環產生超氧化物(O2-)和過氧化氫(H2O2)[14]。氧化損傷是氧化和抗氧化過程失衡的結果，抗氧化防御系統(如SOD)在消除體內氧化循環中起著重要作用。SOD是機體內重要的抗氧化劑，可消除過剩的氧自由基及其衍生物，保護細胞免受損傷[15-17]。IL-8為重要的中性粒細胞趨化因子，是宿主防御病原菌感染機制中起重要作用的前炎性細胞因子，對中性粒細胞具有較強的趨化作用和激活作用[18-19]，IL-8釋放的增加是導致感染肺部中性粒細胞增多最主要的原因。研究證據表明，氧化應激可以引發炎癥，反過來炎癥加劇了活性氧的產生[20]；肺炎性疾病[21]、暴露于環境微粒肺細胞[22]的氧化應激誘導IL-8表達并乙酰化；氧化應激能硝基化人組蛋白脫乙酰化酶2(HDAC2)，導致IL-8表達增加[23]；Ivison等[24]研究表明H2O2通過磷酸化p-38 MAP酶和延長I-κB降解與核因子(NF)-κB激活的協同作用使IL-8產生增加。因此氧化應激引發IL-8表達上調可能是聯系氧化應激和炎癥之間的一個重要環節。

總之，本研究結果提示，作為NO供體的SNAC不僅具有抗菌作用，并可能通過影響ROS、SOD的表達而發揮一定抗氧化作用，但本實驗檢測的炎性因子及抗氧化酶有限，仍需實驗進一步研究。

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銅綠假單胞菌是一種定植于支氣管擴張、肺囊性纖維化、慢性阻塞性肺疾病患者下呼吸道的機會致病菌，可持續刺激宿主免疫反應而致進展性的氣道破壞，具有多重耐藥的特點。一旦感染，臨床治療十分困難，現已成為院內感染的主要致病菌。

綠膿菌素是銅綠假單胞菌分泌的重要的細菌毒力因子之一，可降低支氣管黏液流動速度，有利于銅綠假單胞菌定植于呼吸道；同時，它還逐步降低呼吸道纖毛擺動，最后可發展為廣泛的纖毛停滯，進而導致上皮損傷。