481例高膽紅素血癥新生兒溶血病血清學檢測

馮體玉，張惠琴（廣東省梅州市人民醫院檢驗科 514031）

新生兒溶血病（HDN）是由于胎兒與母親血型不相容，胎兒的紅細胞進入母體循環中，致使母體產生相應的IgG抗體。該類抗體通過胎盤作用于胎兒的紅細胞，使其產生不同程度的溶血現象，從而出現溶血病的癥狀。HDN的血清學檢測主要采用“三項試驗”，即直抗試驗（直接抗人球蛋白試驗）、釋放試驗（抗體釋放試驗）和游離試驗（游離抗體試驗）。微柱凝膠技術具有操作簡便、結果準確且易判讀的優點，本實驗室采用此方法對本院2010年7月至2012年7月檢測的481例高膽紅素血癥新生兒的血液標本進行檢測與統計，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 標本來源 選擇2010年7月至2012年7月出生1周內發生高膽紅素血癥的新生兒的血液標本2mL，用EDTA－K2抗凝全血，抽血后即時送檢即時檢驗，3h內完成。

1.2 主要試劑和儀器 溶血病微柱凝膠檢測卡、6%牛蛋白血清標準、TA－3A型血型血清學多用離心機和FYQ免疫微柱孵育器購自長春博迅生物技術有限公司；ABO紅細胞購自上海血液生物醫藥有限公司。

1.3 參照《全國臨床檢驗操作規程》[1]，采用微柱凝膠技術檢測。

1.3.1 ABO和Rh血型鑒定以及直接抗人球蛋白試驗 將患兒待檢測的紅細胞用生理鹽水配成1%的懸液，然后取50μL加入溶血病檢測卡Ⅰ內，用TA－3A型血型血清多用離心機離心5min（900r／min，2min；1 500r／min，3min），取出判讀結果。

1.3.2 游離試驗 取溶血病檢測卡Ⅱ，在1、2、3孔各加入患者血漿50μL，再分別加入50μL 1%的A、B、O標準紅細胞懸液。

1.3.3 釋放試驗 采用熱放散法。在溶血病檢測卡Ⅱ的第4、5、6孔中各加入患兒的放散液50μL，再分別加入50μL 1%的ABO標準紅細胞懸液。37℃孵育15min，用TA－3A型血型血清學多用離心機離心5min（900r／min，2min；1 500r／min，3min）。

1.3.4 結果判讀 紅細胞留在微柱上端或分布在凝膠中為試驗結果陽性，紅細胞沉降至微柱底部為試驗結果陰性。

1.4 統計學處理 采用SPSS17.0統計學軟件進行數據處理，率的比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 患兒血樣“三項試驗”結果 481例中，15例直抗試驗陽性（陽性率3.1%），123例釋放試驗陽性（陽性率25.6%），114例游離試驗陽性（陽性率23.7%）。“三項試驗”的相互聯系見表1。陽性率從高到低依次為游離試驗＋釋放試驗的陽性率、直抗試驗＋游離試驗＋釋放試驗的陽性率、單項釋放試驗的陽性率，游離試驗＋釋放試驗的陽性率與各項差異均有統計學意義（P＜0.05）。

表1 “三項試驗”各種組合的陽性率情況

2.2 HDN血型分布及各血型性別所占比率結果比較 481例高膽紅素血癥新生兒中123例診斷為HDN。在123例HDN中，A型占49.6%（61／123），B型占50.4%（62／123），O型和AB型均為0，全部患兒Rh血型均為陽性。但A型和B型HDN發生率差異無統計學意義（P＞0.05）。123例HDN中，A型男嬰占25.2%（31／123）、女嬰占23.4%（30／123）；B型男嬰占26.8%（33／123）、女嬰占23.6%（29／123），本組數據中HDN男女性別差異無統計學意義（P＞0.05），見表2。

表2 HDN患兒血型分布及性別結果比較（n）

2.3 HDN患兒血樣“三項試驗”結果 123例HDN中，釋放試驗敏感度最高，陽性為122例，陽性率達99.2%；其次游離試驗陽性為113例，陽性率達91.9%；直抗試驗僅12例陽性，陽性率為9.8%。見表3。

表3 HDN患兒“三項試驗”的陽性率情況

3 討 論

HDN主要的病因是胎兒紅細胞進入母體的循環，胎兒與母體具有不同的血型抗原，該血型抗原刺激母體產生相應的IgG類血型抗體，當該抗體進入胎兒循環與紅細胞上相應的抗原結合，破壞紅細胞而發生溶血。IgG類抗體是最具臨床意義的抗體，引起HDN的血型抗體都是IgG類抗體。在我國，ABO血型不合引起的HDN是最為常見的，ABO系統抗原導致的HDN中，母親血型多為O型。引起HDN的其他血型抗體還有抗－C、抗－c、抗－E、抗－e、抗－K等。不管妊娠婦女的血液中含有以上任何一種IgG類抗體，只要胎兒紅細胞膜上具有相應的抗原，都可能發生HDN。

HDN檢測包括直抗試驗、釋放試驗和游離試驗。其中，直抗試驗是檢測新生兒的紅細胞是否已被母體的IgG類抗體所致敏，釋放試驗、游離試驗則檢測患兒血清中是否有IgG類抗體的存在。目前檢測方法主要有傳統試管法和微柱凝膠法，試管法操作復雜，洗滌放散時間過長不能及時給臨床提供診療結果；結果判斷主觀化，受干擾的因素較多，重復性差；而且在洗滌過程中由于抗原和抗體間的親和力較弱，抗體易被洗脫掉，容易出現假陰性。微柱凝膠技術是建立在傳統血型血清學基礎上的一項免疫檢測技術[2]。該技術通過調節凝膠的濃度來控制凝膠間隙的大小，利用離心力將抗原和抗體反應后的凝集紅細胞留在微柱的上端或分布在凝膠中，未凝集紅細胞則通過間隙到達微柱底部。該方法不用洗滌紅細胞可使抗人球蛋白被殘留蛋白質中和，避免了抗人球蛋白被洗滌后殘留的鹽分稀釋所產生的假陰性[3]。資料顯示，微柱凝膠法敏感度高于試管法，兩者差異有統計學意義（P＜0.05）[4]，微柱凝膠法對抗體效價的檢出水平比試管法平均高出1～3個滴度[5]，與臨床符合率相比，微柱凝膠法也遠高于試管法。

本研究481例高膽紅素血癥新生兒的標本在“三項試驗”中均為陽性者占2.5%（12／481）；游離試驗和釋放試驗陽性而直抗試驗陰性者占21.0%（101／481）；單項釋放試驗陽性者占2.1%（10／481）；單項直抗試驗陽性者占0.4%（2／481）；游離試驗單項陽性為0；“三項試驗”均為陰性占73.8%（355／481）。結果顯示游離試驗＋釋放試驗陽性率與各項差異均有統計學意義（P＜0.05）。本研究結果與文獻[6－7]報道有差異，其單項釋放試驗陽性者占52.5%，所占比例較高，這可能與本時間段內的病例數存在著一定的局限性，其次可能與本地區人口血型基因頻率分布有關，另外可能與采用不同檢測方法和試劑有關，可加大病例數進一步探討分析研究。

481例高膽紅素血癥新生兒確診為HDN 123例，占25.6%，均為ABO血型系統所致的HDN。患兒為A型者，HDN的檢出率49.6%（61／123），B型者HDN的檢出 率50.4%（62／123），兩者檢出率經 χ2檢驗差異無統計學意義（P＞0.05），與羅偉瓊等[8]報道一致，說明ABO HDN的發生率與嬰兒A、B血型無關，在ABO血型中呈正態分布。確診為HDN的123例中ABO引起的直抗試驗為12例，另外，101例放散試驗和游離陽性，11例直抗試驗＋游離試驗＋釋放試驗陽性，10例釋放試驗陽性，1例直抗試驗、游離試驗陽性。理論上HDN患者其釋放試驗都應該是陽性的[9]，出現HDN患者釋放試驗陰性的原因可能是在制備放散液時，離心的溫度和時間未控制好，釋放出的抗體又被重新吸附到紅細胞表面，導致實驗結果出現假陰性。隨后對實驗室診斷的123例HDN病例進行了追蹤隨訪，結果均與本實驗室的診斷相符。因此 “三項試驗”在HDN的診斷中具有重要的臨床價值，其中釋放試驗在HDN的診斷中最為重要，研究結果證實釋放試驗是“三項試驗”中敏感度最高，也是判定HDN最有力的證據[10－11]。

HDN可引起新生兒黃疸、貧血、水腫、肝脾大，甚至膽紅素腦病，使患兒神經細胞受到損害。因此，采用敏感而且準確的實驗檢測技術對HDN早期、準確的診斷有重要的意義。研究發現，出生天數小于或等于3d的患兒HDN檢出率為65.2%，出生天數大于3～7d的患兒HDN檢出率為20.8%，出生天數超過7d的未檢出HDN陽性[12－13]。致敏的紅細胞會在出生后逐漸被破壞，游離抗體也只在出生后幾天內存在，之后會逐漸消失，使HDN漏檢。本研究選取的是出生一周內發生高膽紅素血癥新生兒，其檢出率為25.6%，遠低于出生3d內的檢出率，可能就是游離抗體消失的原因所導致。因此發現高膽紅素血癥的新生兒應盡早檢測“三項試驗”，以提高HDN的檢出率，達到及時治療的效果。

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