基于ITS序列的菊花花枯病實時熒光PCR檢測方法

陳吳健，張明哲，林曉佳，吳 蓉，吳志毅，陳 曦，武 揚，吳旭耀

（1.浙江出入境檢驗檢疫局，浙江杭州 310016；2.杭州出入境檢驗檢疫局，浙江杭州 310012）

基于ITS序列的菊花花枯病實時熒光PCR檢測方法

陳吳健1，張明哲1，林曉佳1，吳 蓉2，吳志毅1，陳 曦1，武 揚1，吳旭耀1

（1.浙江出入境檢驗檢疫局，浙江杭州 310016；2.杭州出入境檢驗檢疫局，浙江杭州 310012）

根據菊花花枯病菌與其近似種在ITS序列上的差異，構建特異性引物和探針，并用菊花上常見的病害及其近似種進行驗證。結果表明，供試菌株中僅菊花花枯病菌表現出陽性擴增信號，其他菌株和空白對照均未檢測到熒光信號。該法可檢測到100 fg的陽性DNA，完成整個檢測只需約2 h，可快速、靈敏地完成進出境菊花產品中菊花花枯病菌的檢測。

菊花花枯病；實時熒光PCR；特異性檢測

菊花花枯病（Didymella ligulicola）是菊花上的重要病害，1982年被列入EPPO（歐洲和地中海植物保護組織）檢疫性有害生物A2名單中，屬于我國的檢疫性病害。1904年該病在美國北卡羅那州首先發現并報道；隨著菊花切花和盆栽菊花的大量生產，為害日益嚴重，英、德、荷蘭、丹麥、加拿大、肯尼亞、坦桑尼亞、日本、澳大利亞、新西蘭等國均有發生，我國目前尚無發生報道［1］。

該病對環境適應能力很強，可在各種惡劣的自然條件下發生，尤其在溫室中常年都可發病。因此該病一旦定殖，將會對我國的菊花產業帶來毀滅性的打擊，即使花費大量的人力和財力，也很難得到根治。鑒于該病危害性嚴重，適應性強，且我國尚無分布，因此加強檢疫是防止該病傳入我國的首要手段。但由于切花產品的特殊性，檢疫周期的長短直接影響著切花產品的品質，傳統的檢疫手段耗時長，難度大，且無法從無癥狀植株上檢出該病，因此篩選出適宜、準確、快速的檢疫鑒定方法，已成為我國菊花生產及菊花商品進出境亟待解決的問題。

本研究根據菊花花枯病菌與其近似種在ITS序列上的差異，設計了特異性的引物和TaqMan-MGB探針，將實時熒光PCR方法運用于菊花花枯病菌的檢測，現將結果報告如下。

1 材料和方法

1.1 供試菌株

取菊花常見病害及其近似菌株進行試驗。標準菌株Didymella ligulicola從CABI購買；番茄亞隔孢菌從ATCC購買，其余供試菌株均為本實驗室分離鑒定（表1）。

表1 供試菌株的學名及其寄主

1.2 通用引物和擴增程序

課題組根據標準菌株提取DNA，用真菌通用引物ITS4和ITS5擴增ITS序列，由大連寶生物技術有限公司合成（ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'；ITS5：5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAA-GG-3'）。擴增程序為：96℃熱變性3 min；進行35個循環，每個循環94℃1 min，55℃1 min，72℃2 min，最后72℃延伸7 min［2］。

1.3 特異性引物、探針的設計

基于真菌rDNA存在著廣泛的保守區域，可用作引物的結合位點，同時存在不同區域進化水平不同的特性，選取菊花花枯病菌rDNA的內轉錄間隔區（internal transcribed spacer，ITS）序列，運用NCBI數據庫信息和DNASTAR軟件的序列比較分析功能，結合PCR引物、探針設計的原則，設計具有菊花花枯病菌特異性的實時熒光PCR引物和探針。

1.4 樣品制備

取健康菊花葉片表面洗凈后，分別接種菊花黑斑病病原細極鏈格孢（Alternaria tenuissima）和鏈格孢（A.alternata），灰霉病病原灰葡萄孢（Botrytis cinerea），白銹病病原堀柄銹菌（Puccinia horiana），菊花花枯病菌（D.ligulicola），25℃保濕培養24 h后，取葉片提取DNA［3］。

1.5 菌株和樣品DNA提取

供試菌株在PDA上培養后，刮取菌絲，液氮研磨后，取0.1～0.2 g備用；剪取有病斑的菊花葉片組織，液氮充分研磨，取0.1～0.2 g，用PROMEGA試劑盒提取DNA。

1.6 實時熒光PCR擴增

PCR試劑均購自寶生物工程（大連）有限公司。反應體系為20μL，包括10μL 2×Premix Ex Taq、上下游引物（5μmol·L-1）各0.4μL和探針（5μmol·L-1）0.8μL，2μL模板DNA、0.4μL 50×ROX Reference DyeⅡ，加無菌水6μL補至20μL。

實時熒光PCR檢測使用儀器為App lied Biosystems的7500 Fast Real-time PCR System。擴增反應條件為：50℃預熱2 min；95℃變性10 min；95℃15 s，60℃1 min，40個循環。

2 結果與分析

2.1 引物和探針

通過Genbank，blast比對，尋找同屬近似種的差異位點，設計特異性引物DL1和DL2，探針Probe-DL，由于涉及到專利和知識產權保護，引物和探針序列在本文中不公開。

2.2 方法特異性檢測

用表1中的菌株對設計的引物和探針進行特異性檢測，結果如圖1所示。只有菊花花枯病菌有陽性擴增，熒光信號以指數形式增長，其他菌株均未檢測到熒光信號。說明設計的引物和探針對菊花花枯病具有很好的特異性。

圖1 方法特異性的檢測結果

2.3 方法靈敏度驗證

將標準菌株DNA測定濃度后，按梯度稀釋為1～6個不同濃度，分別取含有1 ng，100 pg，10 pg，1 pg，100 fg和10 fg的菌絲DNA用于實時熒光PCR檢測，結果顯示，1～5梯度的菌絲DNA均能檢測到擴增的熒光信號，表現為陽性擴增，10 fg的菌絲DNA和陰性對照未檢測到擴增信號（圖2）。

結果表明該檢測方法的檢測靈敏度達到100 fg的菌絲DNA。

圖2 方法靈敏度的檢測結果

2.4 菊花樣品的檢測

將1.4節中制備的樣品DNA進行實時熒光PCR檢測，標準菌株作為陽性對照，健康的菊花葉片作為陰性對照。結果表明，陽性對照和接種菊花花枯病菌的樣品可見陽性擴增曲線，接種其他菌株的樣品和陰性對照無擴增信號。說明該法不僅可用來鑒定菊花花枯病菌菌株，也可用于檢測進出境菊花產品中是否攜帶菊花花枯病菌（圖3）。

圖3 菊花樣品的檢測結果

3 小結和討論

菊花花枯病菌是菊花的毀滅性病害，該病主要侵染菊花花冠，流行快，幾天內可使花冠完全腐爛；也可使切花在運銷過程中大量落花，給商品菊花造成很大的損失。據報道，1975年該病造成了康涅狄格州溫室商品菊花50%以上的損失［4］。為保護菊花產業的健康發展，我國將菊花花枯病菌列入進境檢疫性有害生物名錄，用檢疫手段嚴防其傳入。

目前，傳統的形態學檢疫方法周期長、難度大，已無法滿足當今進出口貿易的實際需求，特別是鮮切花產品，因此分子生物學方法正在被越來越多地應用到進出口植物檢疫中。PCR、實時熒光PCR等技術在油菜莖基潰瘍病、苜蓿黃萎病菌、油棕猝倒病菌等檢疫性真菌病害的鑒定中已得到廣泛應用［5-7］，大幅降低了一線檢疫人員的工作強度，縮短了檢測周期，提高了檢出率。

本研究采用標準菌株，通過對其ITS區序列特征的研究，首次建立了菊花花枯病菌的實時熒光PCR特異性檢測方法，并通過樣品的驗證表明，該方法快捷、靈敏度高、特異性強，能夠檢測到100 fg以上的菊花花枯病DNA樣本，整個檢測過程為2 h左右，能滿足進出境菊花及菊花產品快速通關的要求。

［1］ 朱培良，葛起新.一種危險性病害-菊花疫病［J］.植物檢疫，1987，1（4）：298-301.

［2］ 葉云峰，付崗，劉威，等.貓豆炭疽病病原分離與鑒定［J］.植物保護，2013，39（1）：97-98.

［3］ 方中達.植病研究方法［M］.北京：中國農業出版社，1998.

［4］ Pethybridge S J，Hay F S.Influence of Phoma ligulicola on yield and site factors on disease development in Tasmanian pyrethrum crops［J］.Australasian Plant Pathology，2001，30（1）：17–20.

［5］ 周國梁，尚琳琳，林泓，等.油菜莖基潰瘍病菌的實時熒光PCR檢測［J］.植物病理學報，2011，41（1）：10-17.

［6］ 杜洪忠，吳品珊，嚴進.苜蓿黃萎病菌實時熒光PCR檢測方法［J］.植物檢疫，2011，25（2）：45-47.

［7］ 張慧麗，王建峰，段維軍，等.油棕猝倒病菌實時熒光PCR檢測方法［J］.植物保護，2012，38（6）：98-100.

（責任編輯：張瑞麟）

S 432.44

B

0528-9017（2014）11-1695-04

文獻著錄格式：陳吳健，張明哲，林曉佳，等.基于ITS序列的菊花花枯病實時熒光PCR檢測方法［J］.浙江農業科學，2014（11）：1695-1698.

2014-06-24

浙江檢疫局重點科技項目（2013ZKZ04）；浙江檢疫局科技項目（ZK201110）

陳吳健（1983-），男，農藝師，研究方向為植物病菌真菌、線蟲的檢疫鑒定。E-mail：cw j@ziq.gov.cn。