七十味珍珠丸對(duì)局灶性腦缺血大鼠腦組織中SOD、CAT、MDA的影響

甄麗芳羅遠(yuǎn)帶黃福開(kāi)胡賢達(dá)邵 杰尚 穎劉亞麗杜文兵

（1南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，廣州，510515；2中國(guó)藏學(xué)研究中心北京藏醫(yī)院，北京，100029）

實(shí)驗(yàn)研究

七十味珍珠丸對(duì)局灶性腦缺血大鼠腦組織中SOD、CAT、MDA的影響

甄麗芳1羅遠(yuǎn)帶2黃福開(kāi)2胡賢達(dá)2邵 杰2尚 穎1劉亞麗1杜文兵1

（1南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，廣州，510515；2中國(guó)藏學(xué)研究中心北京藏醫(yī)院，北京，100029）

目的：觀察七十味珍珠丸對(duì)永久性大腦中動(dòng)脈阻塞（Permanent Middle Cerebral Artery Occlusion，PMCAO）大鼠腦組織中超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、過(guò)氧化氫酶（Catalase，CAT）及丙二醛（Maleic dialdehyde，MDA）含量的影響，初步探討其腦保護(hù)作用機(jī)制。方法：取SD大鼠用線栓法制備PMCAO模型。觀察七十味珍珠丸對(duì)大鼠腦梗死體積、腦組織中超SOD、CAT及MDA含量的影響。結(jié)果：與PMCAO模型組比較，七十味珍珠丸高、低劑量組大鼠腦梗死體積都有不同程度的減小（P＜0.01或P＜0.05），腦組織中SOD、CAT含量都有所升高，MDA含量有不同程度下降（P＜0.01）。結(jié)論：七十味珍珠丸可能通過(guò)有效地增強(qiáng)內(nèi)源性抗氧化酶清除自由基的能力、減輕腦組織脂質(zhì)過(guò)氧化損傷來(lái)實(shí)現(xiàn)腦保護(hù)作用的。

七十味珍珠丸；局灶性腦缺血損傷；氧化應(yīng)激

缺血性腦損傷病理過(guò)程涉及鈣超載、氧化應(yīng)激、炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)、興奮性氨基酸毒性、神經(jīng)元細(xì)胞凋亡等，越來(lái)越多的研究表明，氧化應(yīng)激在缺血性腦損傷的病理生理機(jī)制中發(fā)揮了重要的作用。氧化應(yīng)激是指機(jī)體在遭受各種有害刺激時(shí)，機(jī)體內(nèi)自由基的產(chǎn)生和內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)（超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫酶、細(xì)胞色素氧化酶等）之間的嚴(yán)重失衡，導(dǎo)致氧自由基在機(jī)體蓄積而引起細(xì)胞毒性反應(yīng)，從而導(dǎo)致組織損傷的過(guò)程［1］。而自由基反應(yīng)參與了腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞的損害過(guò)程，是導(dǎo)致遲發(fā)性神經(jīng)元損傷的核心環(huán)節(jié)。七十味珍珠丸（Rannasangpei）由金、銀、珍珠、藍(lán)寶石、瑪瑙、麝香、天然牛黃等70味天然動(dòng)、植、礦物類藥經(jīng)煮、燒、泡等特殊的加工方法精制而成。含有較高的鐵、鎂、銅、鉻、鋅以及錳等微量元素［2］。而這些微量元素參與構(gòu)成了抗氧化系統(tǒng)中許多酶的活性中心，由此猜想七十味珍珠丸應(yīng)該具有抗氧化損傷的作用。本次實(shí)驗(yàn)意在通過(guò)觀察七十味珍珠丸對(duì)于局灶性腦缺血大鼠腦梗死體積、腦組織中SOD、CAT及MDA含量的影響來(lái)驗(yàn)證上述猜想是否成立。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥品 七十味珍珠丸由北京藏醫(yī)院提供，批號(hào)：20130109。維腦路通片（曲克蘆丁片）由亞寶藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：20130701。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠80只，體重230～250g，雌雄各半，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：44005900000285。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 氯化三苯基四氮唑（TTC）購(gòu)于Sigma公司。大鼠SOD、CAT及MDA的ELISA試劑盒均購(gòu)自廣州拓科達(dá)生物科技有限公司。

1.4 主要儀器 Thermo酶標(biāo)儀、2K-15低溫離心機(jī)等均由南方醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)樓解剖教研室提供。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 動(dòng)物分組、給藥劑量及方式 購(gòu)買230～250 g SD大鼠80只，隨機(jī)分成兩批，每批隨機(jī)分成5組，即假手術(shù)組，PMCAO模型組；七十味低劑量組（166 mg/kg·d）；七十味高劑量組（664mg/kg·d）；維腦路通組（50 mg/kg·d），每組各8只大鼠。每天灌胃給藥1次（按體表面積法），連續(xù)14 d，于造模前1 h給藥1次，給藥劑量及途徑同前。假手術(shù)組和PMCAO模型組用蒸餾水灌胃。

第一批：進(jìn)行腦梗死體積檢測(cè)（腦片TTC染色及腦梗體積百分比計(jì)算）。第二批：測(cè)定大鼠腦組織中CAT、SOD、MDA的含量。

1.5.2 建立PMCAO模型 采用改良后的Zea Longa模型［3］制作方法。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以10%的水合氯醛（0.32 mL/100 g）腹腔麻醉后，仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上，頸部正中切開(kāi)皮膚及淺筋膜，鈍性分離胸鎖乳突肌與胸骨舌骨肌，暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈（Common Carotid Artery，CCA），沿著頸總動(dòng)脈快速分離勁外動(dòng)脈（External Carotid Artery，ECA）和頸內(nèi)動(dòng)脈（Internal Carotid Artery，ICA）。電凝聯(lián)系ECA與ICA之間的動(dòng)脈。在右ECA主干的遠(yuǎn)心端1.5 cm處結(jié)扎，提拉ECA殘端的結(jié)扎線，用微型血管夾在CCA分出ECA處，將ECA臨時(shí)夾閉，在血管夾與ECA殘端之間結(jié)扎一道縫合線，不打緊。在ECA遠(yuǎn)心端死結(jié)與近心端活結(jié)之間開(kāi)一小口，用制備好的直徑為0.21 mm線栓沿ECA插入，扎緊縫合線，綁住線栓，同時(shí)松開(kāi)微型血管夾。當(dāng)線栓頭端進(jìn)到ICA與ECA的分叉處。剪斷開(kāi)口上端的ECA，使線栓掉頭進(jìn)入右ICA，避開(kāi)翼顎動(dòng)脈（Pterygopalatine Artery，PPA），待線栓標(biāo)記點(diǎn)（距線栓頂端18 mm處做標(biāo)記）進(jìn)到分叉內(nèi)，有阻擋感時(shí)，扎緊線栓，縫合切口。在插線的過(guò)程中要注意手感，當(dāng)遇到阻力時(shí)不要用蠻勁插入，當(dāng)線栓彎曲時(shí)要更換，手法要輕柔、迅速。假手術(shù)組：只是不插入線栓，其他步驟與上述步驟相同。模型成功標(biāo)準(zhǔn)：手術(shù)清醒后Bederson評(píng)分［4］≥l分者，認(rèn)為造模成功，可作為實(shí)驗(yàn)納入患者。

1.6 觀測(cè)指標(biāo)

1.6.1 腦組織TTC染色及梗死體積測(cè)定 第一批各組大鼠手術(shù)24 h后斷頭處死，在生理鹽水冰盤上快速剝離出腦組織，放于-20℃冰箱凍至適當(dāng)硬度，去除嗅球、小腦和低位腦干，其余以2 mm間隔行連續(xù)冠狀切片共6片，放入2%氯化三苯基四氮唑（TTC）磷酸鹽緩沖液中（pH＝7.4）中，37℃水孵育恒溫箱內(nèi)避光孵育30 min后，置于4%多聚甲醛中固定24 h后觀察，正常腦組織著玫瑰紅色，梗死腦組織呈蒼白色。將切片掃描入掃描儀中，保存圖像。運(yùn)行Image Pro Plus 4.5（IPP）圖像處理軟件，計(jì)算腦梗死面積及層面總面積，應(yīng)用公式：V＝（A1+…An）t（V：梗死體積或全腦體積，t：切片厚度，A：各切片梗死面積或總面積）計(jì)算出腦梗死體積及全腦體積，用腦梗死體積百分比（腦梗死體積/全腦體積）來(lái)表示腦組織壞死程度。

1.6.2 腦組織中SOD、CAT及MDA的測(cè)定 第二批各組大鼠手術(shù)24 h后斷頭處死，同時(shí)在冰上取腦，取新鮮右側(cè)半腦組織，稱重；用吸管吸取預(yù)冷的10倍于組織塊重量的勻漿介質(zhì)（冷PBS pH＝7.4），加入玻璃勻漿管，眼科小剪剪碎組織塊；將剪碎的組織倒入玻璃勻漿管中，放入冰水混合的大燒杯中，超聲組織勻漿器制成10%的腦組織勻漿液，將勻漿液以3 000 r/min，離心20 min；取上清液，分裝置-20℃保存，按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定CAT、SOD、MDA的含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS 13.0版統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較用單向方差分析，組間兩兩比較方差齊時(shí)用LSD檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)用Dunntt's T3檢驗(yàn)。

圖1 TTC染色情況比較（0：假手術(shù)組；1：七十味低劑量組；2：七十味高劑量組；3：維腦路通組；4：PMCAO模型組）

2 結(jié)果

2.1 各組腦梗死體積比較（見(jiàn)圖1、表1） 假手術(shù)組大鼠腦梗死體積測(cè)定均為0，即無(wú)梗死灶。而PMCAO模型組大鼠右半腦出現(xiàn)較大面積的白色梗死灶（P＜0.01）。與PMCAO模型組比較，七十味高、低劑量組和維腦路通組大鼠腦梗死體積都有不同程度的減小（P＜0.01或P＜0.05）。七十味高劑量組大鼠腦梗死體積顯著小于維腦路通組（P＜0.01）。而七十味低劑量組大鼠腦梗死體積與維腦路通組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 各組SOD、CAT及MDA含量比較（見(jiàn)表2、表3）

與假手術(shù)組比較，PMCAO模型組大鼠腦組織中SOD、CAT含量明顯下降，而MDA含量顯著升高（P＜0.01）。與PMCAO模型組比較，七十味高、低劑量組和維腦路通組大鼠腦組織中SOD、CAT含量都有所升高，MDA含量有不同程度下降（P＜0.01），其中以七十味高劑量組更為顯著。而七十味低劑量組大鼠腦組織中SOD、CAT及MDA含量與維腦路通組相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 各組大鼠PMCAO后腦梗死體積的比較（±s）

表1 各組大鼠PMCAO后腦梗死體積的比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，ΔP＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與維腦路通組比較，ΔΔP＜0.01。

組別例數(shù)劑量（mg/kg·d）腦梗死體積（%）0.0000±0.00000 PMCAO模型組8蒸餾水54.4700±6.02040Δ七十味低劑量組8 166 40.4550±8.04193*七十味高劑量組8 664 27.4475±7.27801**ΔΔ維腦路通組8 50 41.1325±4.12638假手術(shù)組8蒸餾水**

表2 各組大鼠PMCAO后腦組織中SOD、CAT及MDA含量比較（±s）

表2 各組大鼠PMCAO后腦組織中SOD、CAT及MDA含量比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，▲▲P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01；與維腦路通組比較，ΔΔP＜0.01。

組別例數(shù)劑量（mg/kg·d）SOD（U/L）CAT（U/L）MDA（nmol/L）04102 PMCAO模型組8蒸餾水100.9729±3.47249▲▲1.5306±0.07163▲▲2.8511±0.09876▲▲七十味低劑量組8 166 108.5886±2.65902**1.6415±0.09413**2.6368±0.09393**七十味高劑量組8 664 122.5188±2.94949**ΔΔ1.9168±0.07662**ΔΔ2.3381±0.08349**ΔΔ維腦路通組8 50 109.2335±4.39312**1.6794±0.05102**2.5708±0.08805假手術(shù)組8蒸餾水139.1979±3.18762 2.2063±0.06126 1.9515±0. **

3 討論

大腦中動(dòng)脈（MCA）是人類腦卒中的好發(fā)部位，線栓法造成大腦中動(dòng)脈閉塞（Middle Cerebral Artery Occlusion，MCAO）模型被認(rèn)為是局灶性腦缺血的標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物模型［5］。由于大鼠腦血管解剖結(jié)構(gòu)和功能與人類相近似，種內(nèi)純合性好，便于進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，所以常被用做腦缺血的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。其中永久性大腦中動(dòng)脈阻塞（Permanent Middle Cerebral Artery Occlusion，PMCAO）模型具有制作簡(jiǎn)單、成功率高、術(shù)后感染少、結(jié)果穩(wěn)定等特點(diǎn)，入選為本次實(shí)驗(yàn)患者。

氯化三苯基四氮唑（TTC）是呼吸鏈中吡啶-核苷結(jié)構(gòu)酶系統(tǒng)的質(zhì)子受體，與正常組織中的脫氫酶反應(yīng)而呈紅色，而缺血組織因脫氫酶活性下降，不能反應(yīng)而呈蒼白色［6］。本實(shí)驗(yàn)觀察到假手術(shù)組大鼠冠狀腦組織切面呈均一深紅色，即無(wú)梗死灶。而PMCAO模型組腦組織TTC處理后均見(jiàn)到右側(cè)半球自顳頂皮層至基底節(jié)區(qū)有較大面積的白色梗死灶（P＜0.01），未缺血組織呈深紅色，說(shuō)明腦缺血造成了腦組織大面積壞死，壞死區(qū)與MCA支配的腦區(qū)一致，模型制作成功。與PMCAO模型組比較，七十味高、低劑量組大鼠腦梗死體積都有不同程度的減小（P＜0.01或P＜0.05），以七十味高劑量組更為顯著，說(shuō)明七十味珍珠丸可減小大鼠PMCAO后腦梗死體積，抑制缺血造成的腦損傷，具有較好的腦保護(hù)作用，其中高劑量作用顯著。

自由基廣泛存在于生物體內(nèi)，正常情況下參與藥物及毒物的降解，殺滅細(xì)菌，調(diào)節(jié)免疫功能，而體內(nèi)存在許多內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)（超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫酶、細(xì)胞色素氧化酶等）可以清除自由基，使自由基的生成與清除處于動(dòng)態(tài)平衡，對(duì)機(jī)體并無(wú)有害影響。由于腦缺血時(shí)產(chǎn)生大量自由基，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)自身內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)的清除能力，導(dǎo)致大量毒性自由基在組織細(xì)胞內(nèi)堆積，表現(xiàn)為：1）使脂質(zhì)過(guò)氧化，破壞細(xì)胞膜；2）使蛋白質(zhì)變性；3）使DNA突變；4）RNA大分子損傷。

而SOD是體內(nèi)重要的抗氧化酶，屬于金屬酶，當(dāng)體內(nèi)氧自由基（Oxygen Free Radicals，OFR）生成增多時(shí)，可與超氧陰離子反應(yīng)生成過(guò)氧化氫，再由過(guò)氧化氫酶和谷胱甘肽過(guò)氧化酶轉(zhuǎn)變?yōu)樗瑥亩宄齇FR，保護(hù)細(xì)胞免受損傷［7］。CAT是一種酶類清除劑，是以鐵卟啉為輔基的結(jié)合酶。它可促使自由基H2O2分解為分子氧和水，清除體內(nèi)的H2O2，從而使細(xì)胞免于遭受H2O2的毒害［8］，是生物防御體系的關(guān)鍵酶之一。MDA是機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的最終產(chǎn)物，其含量可以反映組織中自由基的含量和組織細(xì)胞受到自由基攻擊即脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的程度［9］。

與假手術(shù)組比較，PMCAO模型組大鼠腦組織中SOD、CAT含量明顯下降，而MDA含量顯著升高（P＜0.01），說(shuō)明腦缺血造成了自由基的堆積，引起腦組織脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)加強(qiáng)，消耗了過(guò)多的內(nèi)源性抗氧化酶，氧化-抗氧化平衡被打破，機(jī)體抗自由基能力下降，腦組織損傷加重。與PMCAO模型組比較，七十味高、低劑量組大鼠腦組織中SOD、CAT含量都有所升高，MDA含量有不同程度下降（P＜0.01），其中以七十味高劑量組更為顯著；再加之，七十味珍珠丸所含的鐵、鎂、銅、鉻、鋅以及錳等微量元素參與構(gòu)成了抗氧化系統(tǒng)中多種酶的活性中心（其中鋅、銅作為Cu/Zn-SOD的輔基，在其合成與調(diào)節(jié)方面發(fā)揮重要作用；錳參與Mn-SOD的構(gòu)成，在線粒體中發(fā)揮清除超氧陰離子自由基的作用；Fe3+為CAT的輔基，CAT催化過(guò)氧化氫轉(zhuǎn)變?yōu)樗脱鯕猓?0］），從而說(shuō)明七十味珍珠丸能夠增強(qiáng)內(nèi)源性抗氧化酶的活性，清除多余自由基，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)造成的腦損傷，以高劑量作用顯著。

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，七十味珍珠丸可減小局灶性腦缺血大鼠的腦梗死體積，具有較好的腦保護(hù)作用；其機(jī)制可能與其增強(qiáng)內(nèi)源性抗氧化酶的活性，提高機(jī)體的抗氧化能力，減輕腦組織脂質(zhì)過(guò)氧化損傷有關(guān)。

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（2013-12-10收稿 責(zé)任編輯：王明）

Effect of Rannasangpei on the SOD，CAT and M DA in Brain Tissues of Rats with Local Cerebral Ischemia

Zhen Lifang1，Luo Yuandai1，Huang Fukai2，Hu Xianda2，Shao Jie2，Shang Ying1，Liu Yali1，Du Wenbing1
（1 College of Traditional Chinese Medicine，Southern Medical University，Guangzhou 510515，China；2 Beijing Tibetan Hospital，China Tibetology Research Center，Beijing 100029，China）

Objective：To explore the effect of Rannasangpei on the SOD，CAT and MDA in the brain tissues of rats with permanent middle cerebral artery occlusion（PMCAO），and to study its cerebral protective mechanism.Methods：SD rats were made into local cerebral ischemic models with the method of permanent middle artery occlusion.The effects of Rannasangpei on the volume of cerebral infarction in rats and the changes of SOD，CAT and MDA contents in their brain tissues were observed.Results：The infarct volumes of rats in two Rannasangpei intervention groups were obviously decreased compared with the PMCAO model group（P＜0.01 or P＜0.05）；compared with the PMCAO model group，the SOD and CAT contents in brain tissues of the rats in the high and low dose Rannasangpei groups were all significantly increased，the MDA contents were decreased in different degrees（P＜0.01）.Conclusion：Rannasangpei has significant protective effect on cerebral ischemic injury in rats，and its protective mechanism may come from effectively enhancing ability of the endogenous antioxidant enzyme to scavenge the free radicals，and relieving lipid peroxidation damage of brain tissue.

Rannasangpei；Local ischemic injury；Oxidative stress

R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2014.03.029

國(guó)家重大財(cái)政專項(xiàng)“藏醫(yī)心腦血管病臨床研究與藥物研發(fā)”（編號(hào)：1981020421）

甄麗芳（1987.2—），女，研究生，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合腦病，E-mail：530539114＠qq.com

黃福開(kāi)（1958.2—），男，研究生，副主任醫(yī)師，院長(zhǎng)，研究生導(dǎo)師，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病；E-mail：530539114＠qq.com