臍帶間充質(zhì)干細胞治療多系統(tǒng)萎縮小腦型的安全性及療效研究

劉 靜 韓冬梅 丁 麗 薛 梅 王志東 閻洪敏 朱 玲 鄭曉麗 董 磊 郭子寬 王恒湘

臍帶間充質(zhì)干細胞治療多系統(tǒng)萎縮小腦型的安全性及療效研究

劉 靜 韓冬梅 丁 麗 薛 梅 王志東 閻洪敏 朱 玲 鄭曉麗 董 磊 郭子寬 王恒湘

目的觀察臍帶間充質(zhì)干細胞（UC-MSCs）鞘內(nèi)注射，治療多系統(tǒng)萎縮小腦型（MSA-C）的安全性及臨床療效。方法自2009年12月至2012年4月，對40例MSA-C患者給予UC-MSCs鞘內(nèi)注射治療，每次每Kg體重給予1×106個細胞，1次/周，4次為1個療程。本組中29例治療1個療程，9例患者治療2個療程，2例患者治療3個療程。采用世界神經(jīng)病聯(lián)合會國際合作共濟失調(diào)評分量表（ICARS）及日常生活量表（ADL）對患者治療前后的神經(jīng)功能進行評定。治療后對患者進行隨訪。結(jié)果40例MSA-C患者共53個療程，其中47療程有效（有效率88.68%）。11例接受多療程治療的患者中，9例在后續(xù)療程中療效進一步提高。治療結(jié)束1個月后ICARS及ADL均比治療前明顯降低（P＜0.01）。治療有效患者多表現(xiàn)為行走、站立不穩(wěn)，運動遲緩，上肢精細動作障礙，書寫困難，構(gòu)音障礙，眼球運動障礙等臨床癥狀得到改善。治療后常見的不良反應有頭暈（4例）、腰痛（1例）、頭痛（2例）、發(fā)熱（2例），均在1～3 d內(nèi)消失。隨訪27～55個月（中位隨訪時間40個月），無治療相關的副作用發(fā)生，有效患者疾病穩(wěn)定時間為2～13個月（平均5.88±2.86個月），之后疾病再次出現(xiàn)進展。結(jié)論UC-MSC鞘內(nèi)注射治療是安全的，可在一定程度上改善MSA-C患者的臨床癥狀，多療程治療有助于多數(shù)患者神經(jīng)功能的進一步改善，延緩疾病進展。

臍帶間充質(zhì)干細胞多系統(tǒng)萎縮鞘內(nèi)注射

多系統(tǒng)萎縮小腦型（MSA-C）是以小腦共濟運動障礙為主要臨床表現(xiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，最常累及的部位為小腦，還可累及橄欖核、腦橋、脊髓等部位。臨床表現(xiàn)為行走、站立不穩(wěn)，上肢精細動作差，構(gòu)音障礙，意向震顫等。病情呈進行性進展，最后喪失自主生活能力，給家庭、社會帶來極大負擔。藥物治療效果欠佳。而臍帶間充質(zhì)干細胞（UCMSCs）來源于臍帶，易獲取，體外能夠大量擴增，低免疫原性，具有橫向分化潛能，適當條件下可向外胚層的神經(jīng)細胞分化。我們采用UC-MSCs鞘內(nèi)注射治療40例MSA-C患者，取得一定療效。

1 材料與方法

1.1 對象

2009年7月至2013年8月，40例MSA-C患者經(jīng)頭顱MRI檢查及臨床表現(xiàn)確診。男24例，女16例，平均年齡53歲（23歲～74歲），起病時平均年齡49歲（20歲～71歲），平均病程4年（3個月～15年）。治療前如實告知患者治療方案及風險，患者均簽署知情同意書，治療方案經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。所有患者均無干細胞治療禁忌癥，如發(fā)熱、感染、凝血功能及重要臟器功能障礙等。術前對患者進行總體評估，包括體格檢查、ECG、頭顱MRI檢查，以及血、尿、便常規(guī)和肝腎功能、凝血象、手術感染八項檢查等。

1.2 方法

1.2.1 UC-MSCs的制備

按文獻[1]提供的方法，稍加改良后進行UCMSCs的制備。簡言之，經(jīng)知情同意及感染源檢定后收集臍帶，去除外膜和動靜脈，將臍帶剪成0.5 cm3大小的組織塊，加入等體積0.2%Ⅰ型膠原酶，37℃消化過夜。次日，加入兩倍體積的0.05%的胰蛋白酶，37℃消化1 h。2 000 r/min離心10 min收集細胞，計活細胞數(shù)。將細胞懸浮于人MSC無血清培養(yǎng)基（杭州百威）中，按1×106cells/cm2底面積接種于塑料培養(yǎng)瓶中。1周后出現(xiàn)數(shù)十個形態(tài)類似于成纖維細胞的細胞集落，加入0.05%胰蛋白酶消化，并按6 000 cells/cm2底面積進行傳代培養(yǎng)。利用流式細胞術測定細胞表型，常規(guī)感染源檢定后，收集細胞用于治療。或收獲細胞放于-80℃冰箱凍存?zhèn)溆茫们埃?7℃環(huán)境下快速復蘇，24～48 h培養(yǎng)，收獲貼壁生長的細胞供臨床應用。

1.2.2 UC-MSCs鞘內(nèi)注射

入院第3或第4天，患者行腰穿，鞘內(nèi)注射UC-MSCs，1次/周，4次為1個療程。按診療常規(guī)進行腰穿，每次將UC-MSCs 10 mL（1×106cells/Kg）+地塞米松5 mg在10 min內(nèi)緩慢注入蛛網(wǎng)膜下腔，拔針，敷以無菌輔料，囑患者去枕平臥6 h。治療有效患者在半年后可接受下一療程治療。共29例患者接受1療程治療，9例接受2療程治療，2例接受3療程治療。本組所有患者均輔以系統(tǒng)康復鍛煉。

1.2.3 評估標準

采用世界神經(jīng)病聯(lián)合會國際合作共濟失調(diào)評分量表（ICARS）[2]及日常生活量表（ADL）[3]對患者治療前及治療后1個月的神經(jīng)功能及生活質(zhì)量進行評定，分值越高表示神經(jīng)功能缺損越嚴重。

1.2.4 不良反應及并發(fā)癥觀察

觀察治療中及治療后有無發(fā)熱、腰痛、頭痛、頭暈等不良反應。

1.2.5 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 11.5軟件包進行統(tǒng)計處理，計量資料以均數(shù)±標準差表示，治療前后的比較采用配對t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床療效

40例MSA-C患者共53個療程治療中，47個療程有效（有效率88.68%），無效的6個療程中4個療程發(fā)生于接受第1個療程治療的患者，2個療程發(fā)生于接受第2個療程治療的患者。11例接受2個或3個療程治療的患者中，9例在后續(xù)療程治療中神經(jīng)系統(tǒng)功能獲得進一步改善。

40例MSA-C患者53個療程治療結(jié)束1個月與治療前比較，ICARS、ADL評分明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（表1）。

MSA-C患者53個療程治療結(jié)束1個月與治療前ICARS各單項評分比較：姿勢和步態(tài)障礙、動態(tài)功能（共濟運動、描圖）障礙、語言障礙、眼球運動障礙，具有顯著差異（表2）。治療有效患者多表現(xiàn)為行走、站立不穩(wěn)，運動遲緩，上肢精細動作障礙，書寫困難，構(gòu)音障礙，眼球運動障礙等臨床癥狀得到改善。有效的44個療程中，姿勢和步態(tài)改善39例次，動態(tài)功能（共濟運動、描圖）改善38例次，語言障礙改善7例次，眼球運動障礙改善6例次。

表1 患者治療前后ICARS及ADL評分Table1 ICARS and ADL score before and after treatment

表2 患者治療前后ICARS中各單項評分Table2 Each single score of ICARS before and after treatment

2.2 不良反應及并發(fā)癥

UC-MSCs治療中及治療后，患者的生命體征平穩(wěn)。4例腰穿后去枕平臥時感頭暈，起來后癥狀逐漸消失。1例治療后感腰痛，2例頭痛，2例發(fā)熱，未經(jīng)特殊處理，1～3 d后癥狀消失。頭痛患者表現(xiàn)為立位、坐位、活動時頭痛加重，臥位時頭痛減輕或消失，考慮系腰穿術后出現(xiàn)低顱壓綜合征，在后續(xù)治療中通過增加鞘注液體量至15 mL緩慢鞘注后,未再出現(xiàn)頭痛。所有患者均無其他不良反應。

2.3 隨訪

所有患者隨訪27～55個月，中位隨訪時間40個月。隨訪期間無治療相關不良事件發(fā)生，治療有效患者疾病穩(wěn)定時間為2～13個月，平均5.88±2.86個月，之后疾病出現(xiàn)進展。

3 討論

多系統(tǒng)萎縮（MSA）是一組原因不明的，累及小腦、腦干、錐體外系和自主神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病。50～60歲發(fā)病多見，男多于女，為散發(fā)，無遺傳性。疾病進行性發(fā)展，出現(xiàn)運動不能、震顫、平衡障礙、體位性低血壓、癡呆等癥狀，預后差，多在發(fā)病后2～5年內(nèi)部分或全部失去自主生活能力[4]，存活期7～9年，少數(shù)病例存活時間超過15年[5-6]。少突膠質(zhì)細胞的胞質(zhì)α-突觸共核蛋白陽性包涵體是MSA的神經(jīng)病理學特征，α-突觸共核蛋白的異常聚集誘發(fā)神經(jīng)元變性，因此該病被歸于α-突觸共核蛋白病[6-7]。MSA以MSA-C多見，MSA-C小腦及腦干萎縮更為顯著，以小腦性共濟失調(diào)為主要表現(xiàn)。這種神經(jīng)功能的喪失不能被逆轉(zhuǎn)，迄今尚無有效的治療方法。

間充質(zhì)干細胞（MSCs）具有多向分化的潛能，在適宜條件下能向神經(jīng)細胞方向分化[8]，并可分泌大量的生物活性物質(zhì)[9]，在修復中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷和疾病方面具有潛在作用。動物實驗已證明，移植人UC-MSCs治療脊髓損傷（SCI）、神經(jīng)變性疾病（帕金森氏病、MSA、共濟失調(diào)、阿爾海默次病、多發(fā)性硬化）模型大鼠及中風模型大鼠，可改善其神經(jīng)功能，人UC-MSCs分泌的各種神經(jīng)營養(yǎng)因子在神經(jīng)損傷修復中起到重要作用[10-17]。在臨床試驗中，Lee等[18]采用自體骨髓MSCs動脈或靜脈輸注給22例MSA-C患者，經(jīng)過12個月的觀察，與對照組相比，癥狀得到明顯改善，在一定時期內(nèi)延遲了疾病的進展。在前期的臨床試驗中，我們采用UC-MSCs鞘內(nèi)注射治療22例脊髓損傷（SCI）患者，結(jié)果顯示治療是安全的，6例完全性SCI患者均無效，16例不完全性SCI患者有效率達81.25%，其中5例有效患者接受了2個或3個療程治療，療效均有進一步的提高[19]。我們對14例SCA及10例MSA-C患者給予UC-MSC鞘內(nèi)注射治療，除1例MSA患者外，余患者神經(jīng)功能均獲得一定程度改善，且不良反應輕，均能自行恢復[20]。本試驗對40例MSA-C患者采用UC-MSCs鞘內(nèi)注射治療53個療程，治療有效率達88.68%，治療有效患者的神經(jīng)功能得到一定程度改善，表現(xiàn)為行走、站立不穩(wěn)，運動遲緩，上肢精細動作障礙，書寫困難，構(gòu)音障礙，眼球運動障礙等臨床表現(xiàn)得到改善。治療是安全的，有效患者疾病穩(wěn)定時間在半年左右（2～13個月），多療程治療有助于多數(shù)患者神經(jīng)功能的進一步改善，延緩疾病進展。

UC-MSCs來源于人臍帶華爾通膠，具有取材容易、含量豐富、在體外能夠大量擴增的優(yōu)勢[21]，還可將其凍存，應用前復蘇，短時間內(nèi)即可收獲足夠量的細胞用于臨床治療。其高表達CD105、CD73、CD90，不表達CD45、CD34、CD14、CD19以及與移植排斥相關的HLA-DR，在體外長期培養(yǎng)過程中能保持其多向分化潛能，在特定條件下能分化為神經(jīng)細胞，表達神經(jīng)細胞的相關標記和基因，具有低免疫原性，異基因移植不會發(fā)生免疫排斥反應，作為組織工程研究的種子細胞具有廣闊的應用前景[8，16，22]。

MSCs所介導的神經(jīng)保護和神經(jīng)再生的作用機制在許多臨床試驗中得到闡述，MSCs可能通過遷移到損傷部位，分化和替代損傷及死亡的神經(jīng)細胞[16，23]，并分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子，包括腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）、膠質(zhì)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（GDNF）、神經(jīng)生長因子（NGF）、血管內(nèi)皮細胞生長因子（VEGF）、成纖維細胞生長因子（FGF）、胰島素樣生長因子(IGF)、肝細胞生長因子（HGF）等促進血管及神經(jīng)再生，減少神經(jīng)細胞凋亡[11，23]，亦可通過免疫調(diào)控機制抑制慢性炎性反應[13，16－17，23]。

本研究表明，UC-MSCs鞘內(nèi)注射治療MSA-C是安全的，隨訪27～55個月，未發(fā)現(xiàn)有治療相關的不良事件發(fā)生。MSA-C屬進展性神經(jīng)變性疾病，UC-MSCs治療只能在一定時間內(nèi)改善癥狀、延緩疾病進展。治療有效患者通過間歇性多療程治療可以延緩疾病進展。至于每療程的最佳治療次數(shù)、間歇時間、最佳的鞘注MSCs數(shù)量、最好的治療途徑等，還需要大宗病例的隨機對照研究。

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Effectiveness of Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells in Treating Multiple System Atrophy-Cerebellar Type

LIU Jing1,HAN Dongmei1,DING Li1,XUE Mei1,WANG Zhidong1,YAN Hongmin1,ZHU Ling1,ZHENG Xiaoli1,DONG Lei1, GUO Zikuan2,WANG Hengxiang1.
1 Department of Hematology,General Hospital of the Air Force,Beijing 100142,China;2 Department of Experimental Hematology,Beijing Institute of Radiation Medicine,Beijing 100850,China.Corresponding author: WANG Hengxiang(E-mail:wanghengxiang123@aliyun.com).

ObjectiveTo observe the effectiveness of intrathecal injection with umbilical cord mesenchymal stem cells (UC-MSCs)in treating multiple system atrophy-cerebellar type(MSA-C).MethodsFrom December 2009 to April 2012,40 patients with MSA-C were given UC-MSCs intrathecal injection with the dosage of 1×106cells/Kg for once a week,4 times as a course.Twenty-nine patients were treated with 1 course,9 patients with 2 courses and 2 patients with 3 courses. International Cooperative Ataxia Rating Scale(ICARS)and Activity of Daily Living Scale(ADL)were used to evaluate patients'neural function and ability of daily living.Patients were followed up after treatment.ResultsIn 53 courses,47 courses are effective(the effective rate was 88.68%).Compared with the ICARS and ADL scores before treatment,patients’scores were significantly decreased 1 month after treatment(P＜0.01).In most effective cases,clinical symptoms such as unstable walking and standing,slow movement,upper limb fine motor disorder,writing difficulties,dysarthria,eye movement disorders were improved.During treatment,common adverse effects were observed,as dizziness(4 cases),low back pain(1 cases),headache(2 case)and fever(2 cases),all these symptoms disappeared within 1-3 days.No treatment-related adverseevents were observed during 27-55 months(median 40 months)of follow-up.The stable effective period of patients ws 2-13 months(average 5.88±2.86 months),then progressed.ConclusionUC-MSCs intrathecal injection is safe,and can ameliorate clinical symptoms to some extent.Multiple courses of treatment can further improve neurological function and delay illness progression in most patients.

Umbilical cord mesenchymal stem cells;Multiple system atrophy;Intrathecal injection

Q813

A

1673－0364（2014）06－0314－04

2014年9月2日；

2014年9月25日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2014.06.004

首都發(fā)展基金項目（2007-2033）；國家高新技術研究發(fā)展計劃（863項目，2007AA022454）；國家重大新藥創(chuàng)制基金（20092x09503-019）；軍隊臨床高新技術重大項目（2010gxjs049）。

100142北京市空軍總醫(yī)院血液科（劉靜，韓冬梅，丁麗，薛梅，王志東，閻洪敏，朱玲，鄭曉麗，董磊，王恒湘）；100850北京市北京放射與輻射醫(yī)學研究所（郭子寬）。

王恒湘（E-mail：wanghengxiang123@aliyun.com）。