人脂肪來源干細胞與膀胱脫細胞基質-絲素蛋白雙層支架的生物相容性研究

趙 陽 吳稼晟 周 哲 周 娟 張明 李 偉 王 忠 孫康 盧慕峻

人脂肪來源干細胞與膀胱脫細胞基質-絲素蛋白雙層支架的生物相容性研究

趙 陽 吳稼晟 周 哲 周 娟 張明 李 偉 王 忠 孫康 盧慕峻

目的觀察人脂肪來源干細胞（Human adipose derived stem cells，hASCs）在膀胱黏膜下脫細胞基質-絲素蛋白（Bladder acellular matrix graft-silk fibroin，BAMG-SF）雙層支架材料中的生長情況，分析其生物相容性。方法取hASCs，置于BAMG-SF浸提液中培養，CCK-8法檢測其細胞活力，評價BAMG-SF支架的細胞毒性并繪制生長曲線。掃描電鏡觀察BAMG-SF雙層支架材料的表面形貌。將hASCs傳代擴增后接種到BAMG-SF雙層支架材料上，體外培養1周后，轉至裸鼠皮下培養1周、2周，HE染色觀察細胞在支架上的生長情況。HLA免疫熒光鑒定裸鼠皮下雙層支架上細胞的種屬來源。結果hASCs在BAMG-SF雙層支架浸提液中可保持較高的增殖率，根據細胞相對增殖率與細胞毒性分級關系證實BAMG-SF雙層支架浸提液無細胞毒性。由hASCs在BAMG-SF浸提液和DMEM培養基中的生長曲線可知，BAMG-SF有利于hASCs的生長。將hASCs接種到BAMG-SF雙層支架材料上，經過體外、內培養，hASCs均能長入支架的空隙內，且體內培養比體外培養有更多的hASCs細胞長入支架。HLA檢測顯示支架內細胞部分為hASCs。結論新型BAMG-SF雙層支架材料安全無毒，與hASCs生物相容性好，可作為細胞載體應用于組織工程膀胱的研究。

人脂肪來源干細胞膀胱黏膜下脫細胞基質絲素蛋白雙層支架材料組織工程

膀胱大面積缺損的修復一直是臨床面臨的難題。利用胃腸道替代膀胱是目前最常用的方法，但存在著慢性尿路感染、結石、穿孔、尿瘺、電解質紊亂，以及繼發腫瘤等諸多并發癥。組織工程技術為膀胱修復與重建開辟了一條嶄新的途徑，利用組織工程技術修復大面積膀胱缺損已成為新的研究熱點[1-3]。人脂肪來源干細胞（Human adipose derived stem cells，hASCs）來源豐富，取材方便，具有多向分化潛能，可作為種子細胞進行膀胱修復，研究潛能巨大[4-5]。膀胱黏膜下脫細胞基質（Bladder acellular matrix graft，BAMG）是將同種或異種膀胱組織去除細胞，抗原等成分，僅保留細胞外基質成分，因來源于膀胱組織，與人膀胱組織結構最接近，生物相容好，具有修復膀胱組織的獨特優勢，是較為理想的天然生物支架[6-8]。絲素蛋白（Silk fibroin，SF）由蠶繭繅絲脫膠得到，來源豐富，是一種無生理活性的天然結構性蛋白[9]。絲素蛋白有良好的生物相容性，無毒，無刺激性，可部分生物降解，其降解產物對組織無毒副作用，絲素本身具有良好的機械性能和理化性質，如良好的柔韌性和抗拉伸強度、透氣透濕性、緩釋性等，而且經過不同處理可以得到不同的形態，如纖維、溶液、粉、膜以及凝膠等[10-11]。

本實驗將hASCs置于BAMG-SF浸提液中培養，檢測BAMG-SF的細胞毒性，并將hASCs種植于BAMG-SF支架上，進行體外、體內培養，觀察細胞生長情況，探討BAMG-SF作為hASCs的支架材料用于組織工程膀胱缺損修復的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

hASCs取自我院整復外科抽脂術后廢棄的人脂肪組織（獲患者知情同意）。BAMG由豬膀胱經實驗室處理后獲得，BAMG+SF由上海交通大學材料科學與工程學院制作并提供。兔抗人HLA抗體（Abcam公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 hASCs的分離培養

將獲取的人脂肪組織用PBS沖洗3遍，洗去其中的血液和腫脹液。加入等體積的0.1%膠原酶Ⅳ，37℃恒溫振蕩消化1 h，1 500 r/min離心5 min，去除懸浮的脂肪和上清液。加入含10%胎牛血清的低糖DMEM培養基，將細胞重懸。置于37℃含5%CO2的培養箱中進行培養。48 h后首次更換培養液，以后每3天換液1次。待細胞生長融合達80%～90%后，0.25%胰酶-EDTA消化，按1∶3進行傳代培養。

1.2.2 BAMG-SF雙層支架的制備及掃描電鏡觀察

將制備的BAMG剪成15 mm×15 mm的小塊，去離子水洗滌10余遍后，均勻鋪在模具底部，將350 μL絲素蛋白滴在BAMG上，凍干后得到BAMG-SF雙層支架，支架孔徑約100 μm，孔間連通性較好。將材料制備成10 mm×10 mm的補片，乙醇消毒備用。將上述方法制備得到的BAMG-SF雙層支架噴金鍍膜，在液氮中脆斷，噴金處理后，掃描電鏡觀察。

1.2.3 hASCs在BAMG-SF支架浸提液與DMEM培養基中增殖率的測定

BAMG-SF支架用75%乙醇浸泡過夜，PBS洗去殘留乙醇，并加入低糖DMEM完全培養基，置于37℃、5%CO2的培養箱中24 h，收集浸提液，備用。將第3代hASCs接種于96孔板中培養24 h后，吸出培養基，分別添加100 μL低糖DMEM完全培養基（對照組）和100 μL BAMG-SF浸提液（實驗組），繼續培養。于第1、3、5天，每組各取6個孔。每孔加入10 μL CCK-8溶液，混勻后繼續培養2 h。然后酶標儀測定450 nm波長時的A值，計算相對增殖率，并據此進行毒性分級。

1.2.4 hASCs在BAMG-SF支架浸提液與DMEM培養基中細胞生長曲線的測定

將第2代的hASCs接種在10 cm×10 cm的培養皿中，每皿約5×105個細胞。培養皿分為兩組：對照組加DMEM培養基，實驗組加BAMG-SF支架材料浸提液，放入培養箱中，在第1、2、3、4天時，將細胞消化，計算細胞數量，繪制細胞生長曲線圖。

1.2.5 hASCs種植于BAMG-SF支架

將消毒后備用的BAMG-SF支架用PBS沖洗后，加入低糖DMEM完全培養基預培養過夜。將上清及材料表面的培養基吸凈，選取生長較好的第3代hASCs，制成密度為2×107cells/mL的細胞懸液。每個材料表面均勻滴加50 μL細胞懸液，靜置2 h后沿培養皿邊緣緩慢加入低糖DMEM完全培養基，并置于37℃、5%CO2及飽和濕度的培養箱中培養。用于體內試驗的細胞-材料復合物，在體外培養2 d后植入裸鼠皮下。用于體外實驗的支架，仍繼續在培養箱中培養，3 d換液一次。

1.2.6 組織學觀察

體外培養的細胞-支架復合物于培養1周后取材，體內培養的支架材料在1周、2周后分別取材。4%多聚甲醛固定4 h，乙醇梯度脫水，石蠟包埋，切片（4 μm厚），HE染色，光鏡下觀察細胞在支架內的生長情況。

1.2.7 體內培養的細胞-支架復合物免疫熒光檢測

體內培養的細胞-支架復合物于2周后取材，冰凍切片。將切片浸水10 h，洗去OCT，檸檬酸微波法修復抗原，自然冷卻，用0.3%的Triton破膜15 min，滴加羊血清封閉非特異性抗原，一抗為兔抗人HLA抗體，4℃過夜，二抗為帶有紅色熒光標記的羊抗兔抗體，DAPI染細胞核，熒光封片劑封片，避光保存。

1.2.8 統計學分析

SPSS l7.0軟件行統計學分析。數據以x±s表示。實驗組與對照組各時間點A值的比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 hASCs的形態和生長特性

原代細胞培養6～8 h后，有部分成纖維細胞樣細胞貼壁。貼壁細胞呈梭形，其間可見少量三角形、多邊形細胞（圖1A）。隨著培養時間延長，細胞形態為典型的梭形。培養4～6 d，細胞可達80%～90%融合，7～8 d可形成100%融合的致密單層。傳代后的細胞形態主要為梭形，少數為三角形或多邊形（圖1B）。我們前期實驗中的流式細胞鑒定顯示，CD29表達為99.77%，CD44表達為97.1%，CD73表達為96.54%，CD105表達為93.06%，CD45表達為0.37%，CD34表達為1.38%[12]。結果證實得到的是hASCs。

圖1 hASCs形態學觀察（40×）Fig.1 Histological observation of hASCs(40×)

2.2 支架材料的制備

制備的BAMG-SF雙層支架外觀呈白色，掃描電鏡觀察孔徑為100 μm左右。橫截面顯示，上面是SF，下面是BAMG（圖2）。

圖2 BAMG-SF支架材料大體觀及掃描電鏡觀察Fig.2 Gross and SEM observation of BAMG-SF

2.3 hASCs在BAMG-SF支架浸提液與DMEM培養基中增殖率和生長曲線的測定

在第1、3、5天，BAMG-SF浸提液（實驗組）中hASCs的增殖是DMEM完全培養基（對照組）的98.8%、104.2%和111.1%，平均相對增殖率是104.7%，實驗組與對照組無顯著差異（P＞0.05），說明BAMG-SF浸提液對hASCs增殖無明顯影響。兩組的生長曲線無顯著差異（圖3）。依據細胞相對增殖率與細胞毒性分級關系，浸提液在第1、3、5天的細胞毒性分別是I級、0級和0級，說明BAMG-SF浸提液無細胞毒性。

圖3 hASCs在BAMG-SF支架浸提液與DMEM培養基中的生長曲線測定Fig.3 The growth curves of hASCs cultured in theleaching solution of the BAMG-SF and DMEM

2.4 細胞在支架上的生長情況

如圖4所示，hASCs種植到BAMG-SF雙層材料后，經過體內外培養，hASCs均能夠長入支架材料的空隙內。細胞-材料復合物體外培養1周，發現細胞黏附在材料邊緣生長，少量細胞滲透入支架材料內部淺層；體內培養1周后，發現細胞黏附在材料表面，部分在淺層，少量在材料內部；體內培養2周后，發現大量細胞滲透進入材料內部。同時，利用免疫熒光檢測HLA發現，支架內細胞部分陽性染色，說明進入支架內部的細胞一部分是hASCs，一部分是裸鼠自體細胞。

圖4 hASCs復合BAMG-SF雙層支架組織學檢測及免疫熒光檢測（200×）Fig.4 Morphological observation and immunofluorescence observation of BAMG-SF bilayer scaffold combined with hASCs(200×)

3 討論

全球約有4億患者罹患膀胱疾病，僅美國每年就有約5萬例患者被診斷為膀胱癌[13]。特別是浸潤性膀胱癌，需要進行全膀胱切除，卻缺乏有效的修復手段，常用胃腸道代膀胱進行修復，不僅存在多種并發癥，還會造成供區嚴重損傷。近年來，組織工程的發展為膀胱重建帶來了希望。

理想的膀胱修復材料應具有以下性能：良好的生物相容性，可靠的機械性能，能抵抗腹膜內及腹膜外感染，不影響正常腎功能，具有良好的收縮能力，并通過神經和膀胱平滑肌再生后具有自主排尿功能等[14-16]。BAMG來源于膀胱組織，與人膀胱組織結構最接近，生物相容較好，具有膀胱組織修復的獨特優勢，是一種較為理想的天然生物支架。我們前期研究發現，尿路上皮細胞、膀胱平滑肌細胞與BAMG體外構建，能夠形成類似正常膀胱壁的組織結構，實現材料降解與組織器官再生同步化，顯示出人工合成支架材料無可比擬的優勢。但天然BAMG由于孔隙率低，不利于細胞的滲透和厚層組織的再生[17-18]。絲素蛋白（SF）是近年來修復膀胱缺損的常用合成材料之一，其細胞生物相容性好，并具有一定的機械強度，多孔結構也較適合細胞和組織的長入，本身無毒，降解產物也無生物毒副作用，尤其是其直接修補豬膀胱大范圍缺損的成功，展現了Silk作為膀胱擴大修補材料的巨大應用潛能，但單純致密的SF卻存在不易降解等缺點[19-20]。

因此，我們將多孔SF和BAMG復合，形成BAMG-SF雙層復合材料。其中，BAMG具有良好的生物相容性，起到較好的防水性能，而多孔SF主要為平滑肌細胞提供了生長黏附的空間，有利于平滑肌的快速長入，彌補了單純BAMG修補膀胱時因相對致密，平滑肌細胞不易長入，膀胱容量過大，易使膀胱壁擴張變薄，憩室形成等缺點，又解決了致密SF不易降解的問題。所以，本實驗選用BAMG-SF作為支架研究對象。

本實驗中，cck-8實驗結果和生長曲線都顯示各時間點實驗組和對照組無顯著差異（P＞0.05），說明BAMG-SF浸提液不存在明顯的細胞毒性。hASCs種植于BAMG-SF支架后，經體外、體內培養，細胞均能長入BAMG-SF支架的孔隙內，說明BAMG-SF支架具有良好的細胞親和性。

實驗發現，體內培養比體外培養有更多的細胞長入支架，可能是由于體內環境為細胞生長提供了豐富的血供和營養。體外培養1周時，有少量細胞黏附生長在BAMG-SF支架的邊緣，可能由于細胞與材料黏附不牢，經過石蠟包埋處理的復雜過程，部分脫落；體內培養1周，細胞黏附生長在BAMG-SF支架的邊緣，且已有部分滲透到材料內部，體內培養2周后，大量細胞能滲透到材料內部，同時細胞周圍可見大量細胞外基質。HLA-I免疫熒光檢測發現，支架材料內部分細胞陽性表達，說明BAMG-SF支架內的細胞來源于人，即hASCs。

綜上，BAMG-SF復合材料適合hASCs的黏附、生長和增殖。BAMG-SF可以作為理想的支架材料，進一步用于組織工程膀胱修復的研究。

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Human Adipose-Derived Stem Cells and its Biocompatibility with Bladder Acellular Matrix Graft-Silk Fibroin Bilayer Scaffold

ZHAO Yang1,WU Jiasheng2,ZHOU Zhe1,ZHOU Juan1,ZHANG Ming1,LI Wei2,WANG Zhong1,SUN Kang2,LU Mujun1.

1 Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China;2 Shanghai Jiaotong University School of Materials Science and Engineering,Shanghai 200240,China.Corresponding author:LU Mujun(E-mail:lumujun@163.com).

ObjectiveTo observe the growth of human adipose-derived stem cells(hASCs)in bladder acellular matrix graft-silk fibroin(BAMG-SF)bilayer scaffold and to analyze the biological compatibility of BAMG-SF with hASCs.Methods hASCs were isolated from human subcutaneous adipose tissue after collagenase digesting,filtrating and centrifuging,then cultured in the leaching solution of BAMG-SF.The cytotoxicity of scaffold was evaluated by CCK-8 cell viability assay,and the growth curves were also observed.Surface morphology on BAMG-SF was observed by scanning electron microscopy (SEM).The hASCs of passage 3 were seeded onto the BAMG-SF bilayer scaffolds for 1 week,then the BAMG-SF bilayer scaffolds seeded with hASCs were transplanted into nude mouse for 1 week or 2 weeks.The growth of cells in BAMG-SF biomaterials was observed by HE staining.The species origin of these cells in the BAMG-SF scaffolds cultured in vivo was detected by Immunofluorescence.ResultshASCs maintained high proliferation rate in the leaching solution of BAMG-SF and the BAMG-SF scaffolds were nontoxic absolutely.According to the growth curves of hASCs cultured in the leaching solution of the BAMG-SF and DMEM,BAMG-SF scaffolds were conducive to the growth of hASCs.The histological study found that hASCs could grow into the space of the BAMG-SF scaffolds after cultured in vitro and in vivo.There were more cells in the scaffolds cultured in vivo than in vitro.Immuno-fluorescence suggested that some of the cells inside the scaffoldswere hASCs.ConclusionBAMG-SF bilayer scaffolds are nontoxic and have a good biocompatibility with hASCs,which can be used as a vehicle for hASCs in bladder defect reconstruction.

Human adipose-derived stem cells;Bladder acellular matrix graft;Silk fibroin;Bilayer scaffold; Tissue engineering

Q813.1+2

A

1673－0364（2014）06－0309－05

2014年8月21日；

2014年10月9日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2014.06.003

國家自然科學基金項目（81070605，81370860）；上海交通大學“醫工(理)交叉研究基金”（YG2011MS14）。

200011上海市上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院泌尿外科（趙陽，周哲，周娟，張明，王忠，盧慕峻）；200240上海市上海交通大學材料科學與工程學院（吳稼晟，李偉，孫康）。

盧慕峻（E-mail：lumujun@163.com）。