以PECAM-1為標志去除殘留未分化胚胎干細胞的研究

王玲唐 鄭 雅 付 煒 張文杰

·論著·

以PECAM-1為標志去除殘留未分化胚胎干細胞的研究

王玲唐 鄭 雅 付 煒 張文杰

目的以血小板內皮細胞黏附分子-1（Platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1）為標志，去除小鼠胚胎干細胞（Embryonic stem cells，ESCs）中殘留未分化的細胞，以去除其致瘤性，為ESCs在研究中的安全應用提供思路。方法將小鼠R1胚胎干細胞株在撤去白血病抑制因子的培養基中懸浮培養6 d，體外自發分化形成類胚體，消化打散后，以PECAM-1為標志進行磁珠分選，得到陽性與陰性細胞群體，分別以2×106個/點注射入裸鼠背部皮下，6～8周后觀察畸胎瘤形成情況，組織學分析瘤體構成。結果裸鼠背部成瘤結果顯示，PECAM-1+細胞群注射8個點中7個成瘤，成瘤率87.5%；而PECAM-1-細胞群注射8個點中1個成瘤，成瘤率12.5%。PECAM-1+細胞群與PECAM-1-細胞群成瘤率具有統計學差異（P=0.01）。結論應用PECAM-1可去除體外分化過程中的殘留未分化ESCs，并去除其致瘤性。

胚胎干細胞殘留血小板內皮細胞黏附分子-1

胚胎干細胞（Embryonic stem cells，ESCs）具有自我更新和無限增殖能力，可分化為生物體所有的細胞類型，在細胞治療和再生醫學中具有廣泛的應用前景，而致瘤性仍然是ESCs未來臨床應用中面臨的重大問題。研究證實，即使極少量的ESCs植入裸鼠體內也會導致畸胎瘤的產生，并且將ESCs體外分化后高純度分選移植裸鼠體內，也不能避免畸胎瘤的產生[1-3]。有研究認為，畸胎瘤的形成是由于ESCs體外誘導分化過程中，殘留有未分化的ESCs所致；ESCs分化殘留的產生是細胞培養過程中染色體突變造成的[4]。我們的前期研究證實，ESCs體外分化殘留是ESCs的固有特性[5]。許多研究都致力于去除殘留未分化的胚胎干細胞，如引入自殺基因[6-8]、腫瘤抑制基因干擾[9-10]，利用細胞毒性抗體[11]或多能干細胞特異性表面標志物[12]。以階段特異性胚胎抗原-5（Stage-specific embryonic antigen-5，SSEA-5）為標志物，利用流式細胞分選技術，可去除人胚胎干細胞中殘留未分化的細胞，降低畸胎瘤形成率。SSEA-1是比較公認的小鼠未分化胚胎干細胞的表面標志物[1]，認為PECAM-1+/SSEA-1+細胞可能是殘留未分化的胚胎干細胞[13]。我們在前期研究中，將畸胎瘤組織中SSEA-1陽性與陰性細胞分選后，給予胚胎干細胞培養條件培養后，發現SSEA-1陽性與陰性細胞均有克隆產生，提示SSEA-1可能并非理想的去除殘留未分化細胞的標志。本研究以PECAM-1為標志，探討應用PECAM-1去除殘留未分化細胞的可行性。

1 材料和方法

1.1 材料

小鼠R1胚胎干細胞系由中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所贈送。

雄性BALB/c裸鼠16只，6周齡，體質量約20 g。動物購自中國科學院上海實驗動物中心上海斯萊克實驗動物有限責任公司；動物生產許可證號為SCXK（滬）2007-0005，使用許可證號為SYXK（滬）2007-0007。

高糖DMEM、15%FBS（Invitrogen公司，美國）；I MEM（Gibco公司，美國）；2 mmol/L L-谷氨酰胺、10 ng/mL絲裂霉素、50 μmol/L 1-硫代甘油（Sigma公司，美國）；10 ng/mL重組人LIF（Chemicon公司，美國）；生物素結合的大鼠抗小鼠CD31抗體、Streptavidin-PE/Cy5（BD Pharmingen公司，美國）；抗生物素MACS微珠、MASC（Miltenyi公司，德國）；FASC（Beckman公司，美國）。

1.2 ESCs培養和誘導分化

1.2.1 細胞培養

ESCs常規培養液為高糖DMEM、15%FBS、50 μmol/L MTG、2 mmol/L L-谷氨酰胺和10 ng/mL重組人LIF。10 ng/mL絲裂霉素處理后的MEFs作為滋養層細胞。

1.2.2 誘導分化

ESCs分化前，先在0.1%明膠上傳1代；0.25%胰蛋白酶消化后，接種于培養皿，細胞濃度為（2～5）×104cells/mL。每個培養皿添加10 mL培養液。類胚體分化培養液為IMEM、15%FBS、50 μmol/L MTG、50 μg/mL抗壞血酸（Vit C）和2 mmol/L L-谷氨酰胺。培養液每3天半量換液。

1.3 磁珠分選和流式細胞儀純度分析

1.3.1 磁珠分選

分離第6天類胚體中PECAM-1陽性細胞和陰性細胞群體。收獲第6天類胚體細胞，消化為單細胞，以1×106cells/mL重懸于含0.5%胎牛血清的PBS中，加入抗生物素結合的大鼠抗小鼠CD31抗體（1∶200），克隆號為13.3，4℃孵育30 min。PBS漂洗3次后，以1.25×108cells/mL重懸于含加入0.5%胎牛血清的PBS中，加入抗生物素MACS微珠（1∶4），4℃孵育15 min，加入PBS，300 g漂洗10 min后，上機進行兩次陰性選擇，得到PECAM-1陽性細胞和陰性細胞群。

1.3.2 流式細胞儀分析

檢測磁珠分選后PECAM-1陽性和陰性細胞群體純度。取磁珠分選所得部分細胞，以1×106cells/mL重懸于含4%胎牛血清的PBS中，分別加抗生物素結合的大鼠抗小鼠CD31抗體（1∶200），克隆號為390，4℃孵育3 min。PBS漂洗3次后，加Streptavidin-PE/Cy5（1∶1 000），4℃暗處孵育30 min，PBS漂洗3次后，上機檢測，結果用Flowjo軟件分析。

1.4 畸胎瘤實驗

檢測磁珠分選所得兩群細胞體內分化形成畸胎瘤的能力差異。將磁珠分選所得兩群細胞分別懸浮在含10%血清的DMEM中，將2×106個細胞（0.2 mL）注射至BALB/c裸鼠側背部皮下，左側為PECAM-1+細胞群，右側為PECAM-1-細胞群，左右各8個點位。6周后注射部位取材，觀察瘤體形成情況。瘤體標本4%多聚甲醛固定、石蠟包埋切片、HE染色，光學顯微鏡觀察瘤體組織構成。

1.5 統計學分析

使用SPSS 19.0軟件進行統計學分析，采用卡方檢驗，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 ESCs體外分化為EBs

正常傳代培養的ESCs呈緊密的巢狀克隆樣生長，邊緣光整（圖1A）。將ESCs經0.25%胰蛋白酶消化打散后，以（2～5）×104cells/mL的細胞量接種于細菌培養皿，細胞在撤去LIF的培養基中呈懸浮生長，聚集成球，形成EBs（圖1B）。球體邊緣規整，透亮。

圖1 R1-ESCs體外分化（標尺：100 μm）Fig.1 The differentiation of R1-ESCs cells (Scale bars:100 μm)

2.2 磁珠分選所得細胞純度分析

第6天EBs中PECAM-1的表達量為25.6%左右（圖2A）。為進一步明確經MACS分選的PECAM-1+和PECAM-1-細胞群的純度，運用流式細胞分析儀分別對其進行檢測。檢測結果用Flowjo軟件進行分析。分選得到的PECAM-1+細胞群中純度約為63.6%（圖2B），而PECAM-1-細胞群純度約為94.4%，其中仍然含有5.6%PECAM-1+細胞（圖2C）。

圖2 PECAM-1+和PECAM-1-細胞純度分析Fig.2 Purity of PECAM-1+cells and PECAM-1-cells

2.3 畸胎瘤形成及結果統計

為檢測PECAM-1是否可作為理想的剔除致瘤細胞的標志，達到在ESCs分化環境中去除其致瘤性的目的，將分選得到的PECAM-1+和PECAM-1-細胞按相同細胞量2×106個/點分別注射入裸鼠背部皮下（圖3A），6～8周后觀察畸胎瘤形成情況（圖3B）。將畸胎瘤形成情況進行統計，發現PECAM-1+細胞群注射8個點中7個成瘤，成瘤率87.5%；而PECAM-1-細胞群注射8個點中1個成瘤，成瘤率12.5%。PECAM-1+細胞群與PECAM-1-細胞群成瘤率具有統計學差異（P=0.01）。

圖3 PECAM-1+和PECAM-1-細胞畸胎瘤形成實驗Fig.3 The teratomas formation by PECAM-1+cells and PECAM-1-cells in vivo

2.4 畸胎瘤HE染色

注射后6～8周，PECAM-1+細胞與PECAM-1-細胞注射部位均有畸胎瘤形成，PECAM-1+細胞所形成畸胎瘤與PECAM-1-細胞所形成的畸胎瘤大小無明顯差異（圖4A）。HE染色顯示，PECAM-1+細胞與PECAM-1-細胞所成畸胎瘤瘤體中，均存在成熟的內胚層、中胚層和外胚層組織（圖4B、C）。

圖4 PECAM-1-和PECAM-1+細胞形成畸胎瘤組織學分析Fig.4 Histological observation of teratomas formation by PECAM-1-cells and PECAM-1+cells

3 討論

胚胎干細胞的致瘤性風險仍然是制約其臨床應用的最核心問題。其致瘤的原因，有研究認為與胚胎干細胞體外分化過程中殘留的未分化干細胞有關。如何有效去除殘留的未分化細胞成為了研究的熱點問題。通常采用兩種方法：一種以目的細胞為焦點，選擇目的細胞特異性標記陽性的細胞，去除其他類型細胞；一種以殘留干細胞為靶點，選擇干細胞特異性標記，去除殘留干細胞，保留所有其他類型細胞。兩者各有優缺點，前者目標細胞明確，但細胞類型單一，可能遺漏其他在移植中具有輔助功能的細胞；后者包含不同分化階段的細胞，移植效果可能更好，但必須找到合適的分化殘留細胞標記。

殘留未分化細胞標志物的選擇從已知的胚胎干細胞標志物著手，PECAM-1和SSEA-1是小鼠胚胎干細胞的標志。我們的前期研究發現，SSEA-1并不是合適的去除殘留細胞的標志物（未發表數據）。因此，本研究著重探討PECAM-1這一細胞表面標志。文獻報道，PECAM-1不僅在成體組織的血管內皮細胞和造血系統的細胞上表達，同時也在鼠類胚胎干細胞的分化過程中及早期小鼠胚胎中表達，且未分化的胚胎干細胞也表達PECAM-1[13-19]。Yue等[13]對PECAM-1的表達量進行了基因水平和蛋白表達水平的研究，發現PECAM-1在ESCs中高表達，在體外分化早期1～2 d內表達迅速降低，5～6 d后逐漸回升，前期降低與ESCs分化有關，后期升高與血液和內皮細胞分化形成有關，在晚期20 d的EBs中依然有部分細胞共表達PECAM-1和SSEA-1，提示了這部分細胞很可能就是殘留未分化的細胞。因此，我們選取了PECAM-1作為標志開展了本研究。

實驗結果提示，致瘤細胞在PECAM-1+細胞群中富集，成瘤率高，但在PECAM-1-細胞群中也有個別畸胎瘤的產生，其原因很可能是由于細胞分選的純度低而引起的。流式細胞儀分析結果顯示，分選后的細胞中PECAM-1+細胞的純度達60%以上，但即使混有40%左右的陰性細胞，也不會影響其形成畸胎瘤。而在PECAM-1-細胞群中，即使純度達95%，但仍有5%左右的陽性細胞混在其中，這些混雜的細胞足以形成畸胎瘤。從陽性和陰性細胞的成瘤率統計分析可以看到兩者有顯著差異，提示了以PECAM-1為殘留細胞標志物的可行性，但細胞分選技術有待提高。通常磁珠分選的純度相對較低，如果要得到高純度的細胞，流式細胞儀分選的效果更佳，但同時會面臨分選時間長、對細胞損傷大等缺點。本實驗明確了可以PECAM-1為殘留細胞的標志，以此為標的的靶向性清除（包括分選、藥物殺傷等）技術的開發，有望為解決分化殘留細胞導致的致瘤性問題提供可行的方案。

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Removal of Ofteratoma-forming Cells from Differentiated Embryonic Stem Cells Based on PECAM-1 Expression

WANG Ling,TANG Zhengya,FU wei,ZHANG Wenjie.
Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai Key Laboratory of Tissue Engineering, Shanghai Stem Cell Institute,Shanghai 200011,China;National Tissue Engineering Center of China,Shanghai 200241, China.Corresponding author:ZHANG Wenjie(E-mail:wenjieboshi@aliyun.com).

ObjectiveTo prevent teratoma formation by removal of the residual undifferentiated cells from differentiated mouse embryonic stem cells(mESCs)based on PECAM-1 expression,to hopefully promote the safe use of ESCs-based treatment in future.MethodsMouse R1 ESCs were cultured in suspension to form embryoid bodies(EBs)in the absence of leukemia inhibitory factor for 6 days.EBs were then digested into single cells and sorted by magnetic activated cell sorting (MACS)based on PECAM-1 expression.Total of 2×106PECAM-1+and PECAM-1-cells were injected subcutaneously into nude mice respectively.Teratoma formation was measured after 6-8 weeks.ResultsSeven out of 8 injected points formed teratoma in the PECAM-1+cells after 8 weeks of injection,with a tumor formation rate of 87.5%.While only 1 out of 8 injected points formed teratoma in the PECAM-1-cells,with a tumor formation rate of 12.5%.A significantly difference was observed between PECAM-1 positive and negative cells(P=0.01).ConclusionPECAM-1 is a specific marker for residual cells,which could be utilized to remove residual undifferentiated ESCs from in vitro differentiated ESCs,and eventually solve the tumorigenicity problem of ESCs.

Embryonic stem cells;Residual;Platelet endothelial cell adhesion molecule-1

Q813.1+1

A

1673－0364（2014）06－0301－04

2014年9月2日；

2014年10月15日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2014.06.001

國家重點基礎研究發展規劃項目（“973”項目，2011CB964704）；國家自然科學基金（81271714，31170944）。

200011上海市上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院整復外科，上海市組織工程研究重點實驗室；200241上海市組織工程國家工程研究中心。

張文杰（E-mail：wenjieboshi@aliyun.com）。