甜菜堿處理對枇杷果實采后冷害和活性氧代謝的影響

孫玉潔，金 鵬*，單體敏，許 佳，鄭永華

（1.南京農業大學食品科技學院，江蘇 南京 210095；2.浙江大學生物系統工程與食品科學學院，浙江 杭州 310058）

枇杷（Eriobotrya japonica Lindl.）是我國著名的特產水果，原產于中國東南部，主要分布在長江以南各省市，枇杷果肉酸甜適度，營養成分豐富，深受消費者喜愛。但枇杷成熟于初夏高溫季節，采后生理代謝十分旺盛，極易腐爛變質，常溫貯藏時還容易發生果實失水皺縮。由于枇杷果皮薄，采收和運輸過程中易造成機械損傷，使果實變褐色，甚至腐爛[1]，大大降低了商品價值。因此研究枇杷的有效貯藏保鮮技術具有重要的意義。

甜菜堿（glycine betaine，GB）是一種含羧基的季銨類生物堿，在植物、動物、細菌、真菌中均有廣泛分布。甜菜堿在高等植物體內是一種重要的非毒性滲透調節物質，具有穩定生物大分子的結構和功能以及降低逆境條件下滲透失水對細胞膜、酶及蛋白質結構與功能的傷害，從而提高植物對各種脅迫因子的抗性[2]。甜菜堿在其生物合成反應中沒有反饋抑制，所以對維持逆境脅迫下植物的代謝和生存具有重要的生理意義[3]。國內外已有研究表明甜菜堿能提高植物和果實的抗冷能力。張海英等[4]研究發現10 mmol/L甜菜堿處理能夠使黃瓜果實維持較高的超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性，降低O2－·產生速率，減輕黃瓜的冷害癥狀。此外，在冷藏辣椒果實中發現，5 mmol/L甜菜堿處理能提高過氧化物酶（peroxidase，POD）和過氧化氫酶（catalase，CAT）活性，減輕辣椒冷害發生[5]。本實驗以‘解放鐘’枇杷果實為試材，研究1、5、10、20 mmol/L甜菜堿處理對枇杷果實品質的影響，并選擇最優處理組研究甜菜堿處理對枇杷果實活性氧代謝的影響，以期解釋甜菜堿處理抑制枇杷果實冷害發生的機理，為甜菜堿處理在枇杷貯藏保鮮中的應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

以‘解放鐘’枇杷（Eriobotrya japonica Lindl.cv.Jiefangzhong）果實為材料，于2012年5月16日采收于福建莆田市常太鎮枇杷生態果園，果實于正常食用成熟度（果肉硬度為2.0～2.2 N，總可溶性固形物（total soluble solid，TSS）含量為9.2%～9.4%）人工采收，采用泡沫網袋單果包裝，裝入紙箱中，當天運回南京實驗室。選擇大小基本相同、無病蟲害、無機械損傷的果實。

甜菜堿、Follin試劑 美國Sigma公司；愈創木酚、對氨基苯磺酸、四氯化鈦、抗壞血酸（ascorbic acid，ASA） 國藥集團化學試劑有限公司；核黃素、甲硫氨酸中國惠興生化試劑有限公司；氮藍四唑（nitrotetrazolium blue chloride，NBT）南京基天生物技術有限公司；α-萘胺上海泗聯化工廠；鹽酸羥胺北京化工廠；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、醋酸、醋酸鈉均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

TA-XT2i型質構儀 英國Stable Micro System公司；GL-20G-H型冷凍離心機 上海安亭科學儀器廠；DDS-11A 型電導率儀 上海第二分析儀器廠；UV-1600型分光光度計 上海美譜達儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

將挑選出的果實隨機分為4 組，在20℃條件下，將處理組枇杷果實分別置于1、5、10、20 mmol/L甜菜堿溶液中，對照組置于蒸餾水中，浸泡5 min。處理完成后自然風晾干，然后將枇杷果實用0.01 mm厚聚乙烯塑料袋分裝，每袋30個果實（約1 kg），每個處理10袋果實，袋口用普通橡皮筋繞兩道，每組處理重復3次，于（1±1）℃、90%相對濕度條件下貯藏5 周。貯藏期間在每隔1周取樣進行分析測定相關指標。

1.3.2 指標測定

1.3.2.1 果肉硬度的測定

用TA-XT2i質構儀測定果實去皮后硬度。探頭直徑為5 mm，下壓距離為5 mm，每次測定10個果實，取平均值。

1.3.2.2 果肉出汁率的測定

將果實去皮去核后用直徑6 mm的打孔器取肉柱，再切成薄厚均勻的片狀，從中取6 片放入已稱質量的塞有吸水紙的離心管（m1）中并稱質量（m2），5 000×g離心10 min后取出果肉，再將帶汁離心管稱質量（m3）。按照公式（1）計算果肉出汁率：

1.3.2.3 TSS和可滴定酸（titratable acidity，TA）含量的測定

TSS含量：采用手持折光儀測定，結果以%表示；TA含量：采用酸堿滴定法測定，用0.1 mol/L NaOH溶液滴定20 mL果汁至pH值為8.2，結果以蘋果酸百分數含量表示。

1.3.2.4 相對電導率與丙二醛（malonaldehyde，MDA）含量的測定

相對電導率：取6個果實的果皮，去離子水洗滌后用吸水紙吸干水分，用6 mm打孔器取果皮小圓片放入刻度試管中，加入25 mL去離子水，搖勻后靜置1 h，用DDS-11A型電導儀測定，之后將其煮沸30 min，待冷卻后再測定，重復3次。前后兩次讀數的百分比即為相對電導率。

MDA含量：參照趙世杰等[6]的方法進行測定，結果以nmol/g表示，以鮮質量計。

1.3.2.5 果心褐變指數測定

取10個果實，沿果柄縱向切開，按褐變發生程度分為5個等級，即0級，無褐變；1級，輕微褐變，褐變面積小于5%；2級，輕度褐變，褐變面積為5%～25%；3級，中度褐變，褐變面積為25%～50%；4級，重度褐變，褐變面積大于50%。按照公式（2）計算褐變指數：

1.3.2.6 O2－·產生速率、H2O2含量的測定

O2－·產生速率：參照Elstner[7]的方法進行測定，結果以nmol/（min·g）表示，以鮮質量計。

H2O2含量：參照Patterson等[8]的方法進行測定，結果以μmol/g表示，以鮮質量計。

1.3.2.7 總酚、總黃酮含量的測定

總酚含量：采用Folin-Ciocalteu試劑法，參照Slinkard等[9]的方法進行測定，結果以mg/100 g表示，以鮮質量計。

總黃酮含量：參照弓志青等[10]的NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法并稍作改進，1 mL酶液加5%亞硝酸鈉溶液0.06 mL，混勻，加10%硝酸鋁溶液0.06 mL，混勻，放置3 min，再加4%氫氧化鈉溶液0.8 mL，用60%乙醇溶液稀釋定容至2 mL，搖勻，放置10 min。以樣品空白為對照，測定510 nm波長處的吸光度，計算總黃酮含量，結果以mg/100 g表示，以鮮質量計。

1.3.2.8 CAT、抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）、SOD、PPO、POD活性的測定

CAT活性：參照Cakmak等[11]的方法進行測定，略作改進。其中，3 mL酶活力測定反應液中含50 mmol/L pH 7.0磷酸緩沖液2.6 mL、酶液0.2 mL、0.75% H2O20.2 mL，混勻后測定吸光度，然后30℃保溫10 min后再次測定吸光度。以每克鮮樣酶促反應體系每分鐘在240 nm波長處吸光度減少0.01為1個酶活性單位，結果以U/g表示酶活性，以鮮質量計。

APX活性：參照Nakano等[12]的方法進行測定，略作改進。其中，3 mL酶活力測定反應液中含50 mmol/L pH 7.0磷酸緩沖液2.5 mL、9 mmol/L抗壞血酸溶液0.1 mL、酶液0.4 mL、30% H2O20.01 mL。以每克鮮樣酶促反應體系每分鐘在290 nm波長處吸光度減少0.01為1個酶活性單位，結果以U/g表示酶活性，以鮮質量計。

SOD活性：參照Rao等[13]的方法進行測定，以每克鮮樣酶促反應體系每分鐘在560 nm波長處對NBT光化還原的抑制為50%為1個酶活性單位，結果以U/g表示酶活性，以鮮質量計。

PPO活性：參照Murr等[14]的方法測定，以每克鮮樣酶促反應體系每分鐘在410 nm處吸光度增加0.01為1個酶活力單位，結果以U/g表示，以鮮質量計。

POD活性：采用愈創木酚法，參照Kochba等[15]的方法測定，以每克鮮樣酶促反應體系每分鐘在470 nm波長處吸光度增加0.01為1個酶活力單位，結果以U/g表示，以鮮質量計。

1.4 統計方法

各指標測定均為3次重復。應用SPSS軟件進行統計分析，差異由鄧肯氏多重比較法在0.05的水平下進行檢驗。

2 結果與分析

2.1 不同濃度GB處理對枇杷果實品質的影響

如表1所示，不同濃度的GB處理均顯著保持較低的枇杷果肉硬度（P＜0.05），其中以10 mmol/L GB處理效果最明顯。在貯藏第3周，不同濃度的GB處理枇杷果肉出汁率均顯著高于對照果實（P＜0.05），而貯藏第5周10 mmol/L GB處理枇杷果肉出汁率顯著高于對照果實和其他濃度處理果實。枇杷果實在貯藏期間TSS和TA含量均不斷下降，不同濃度的GB處理均有效抑制果實TSS含量的下降。在貯藏第3周和第5周，GB處理果實TSS含量均顯著高于對照果實（P＜0.05），但在貯藏第3周各處理之間無明顯差別。GB處理果實TA含量無顯著影響。這表明GB處理能較好地保持枇杷果實采后品質，其中以10 mmol/L GB處理效果最好，因此后面的生理代謝分析選用10 mmol/L GB處理。

表1 GB處理對冷藏枇杷果實品質指標的影響Table1 Effect of GB treatment on quality parameters in cold-stored loquat fruits

2.2 GB處理對枇杷果實果心褐變的影響

圖1 GB處理對枇杷果實果心褐變的影響Fig.1 Effect of GB treatment on internal browning index in cold-stored loquat fruits

枇杷果實在1℃條件貯藏2 周后開始出現果心褐變癥狀，并且隨著貯藏時間延長而不斷上升。如圖1所示，10 mmol/L GB處理顯著抑制了果心褐變指數的上升（P＜0.05），在貯藏3 周和5 周后，對照組果實果心褐變指數分別達到42.6%和58.3%，而經過GB處理的枇杷果實褐變指數僅為23.5%和38.6%。這表明GB處理有效地減緩了枇杷果實采后冷害的發生，從而延長果實貯藏壽命。

2.3 GB處理對枇杷果實相對電導率和MDA含量的影響

如圖2所示，枇杷果實相對電導率和MDA含量在貯藏過程中不斷增加，10 mmol/L GB處理顯著抑制了相對電導率的上升（P＜0.05），從而保持了細胞膜良好的完整性。MDA為細胞膜脂過氧化產物，在枇杷果實采后冷害過程中，其含量不斷增加。從圖2B可以看出，GB處理有效抑制了MDA的積累，表明GB處理對減輕枇杷果實細胞膜損傷起到了有效作用，這與GB處理減輕了果實的冷害密切相關。

圖2 GB處理對枇杷果實相對電導率（A）和MDA含量（B）的影響Fig.2 Effect of GB treatment on electric conductivity (A) and MDA content (B) in cold-stored loquat fruits

2.4 GB處理對枇杷果實CAT、APX、SOD活性的影響

圖3 GB處理對枇杷果實CAT（A）、APX（B）和SOD（C）活性的影響Fig.3 Effect of GB treatment on catalase activity (A), ascorbate peroxidase activity (B) and superoxide dismutase activity (C) in cold-stored loquat fruits

CAT、APX和SOD是果實組織中清除活性氧自由基的抗氧化酶類。枇杷果實在1℃貯藏期間，CAT活性逐漸下降（圖3A），APX活性呈緩慢降低趨勢（圖3B），而SOD活性在貯藏第2周上升隨后下降（圖3C）。10 mmol/L GB處理顯著保持了較高的CAT和APX活性。貯藏5 周后，GB處理的枇杷果實CAT和APX活性分別比對照果實高47.3%和12.2%。GB處理在貯藏第2周明顯誘導提高了SOD活性（P＜0.05），在貯藏第3周后，處理果實與對照果實SOD活性無顯著差別。

2.5 GB處理對枇杷果實O2－·產生速率和H2O2含量的影響

圖4 GB處理對枇杷果實O－·產生速率（A）和HO含量（B）的影響222Fig.4 Effect of GB treatment on superoxide anion radical generation rate (A) and H2O2 content (B) in cold-stored loquat fruits

由圖4可以看出，O2－·產生速率和H2O2含量在整個貯藏期間不斷增加，10 mmol/L GB處理可顯著抑制O2－·產生速率和H2O2含量的上升（P＜0.05），減少這兩種活性氧自由基在枇杷果實組織中的積累。枇杷果實貯藏5 周后，GB處理的枇杷果實的O2－·產生速率比對照組果實降低27.6%，H2O2含量比對照組果實降低23.2%。

2.6 GB處理對枇杷果實PPO、POD活性的影響

冷藏枇杷果實中PPO和POD活性隨貯藏時間迅速上升，而GB處理能顯著抑制這兩種酶活性的升高（P＜0.05）。在貯藏3 周和5 周后，GB處理的果實PPO活性分別比對照果實低13.1%和9.7%，而POD活性分別對照果實低19.1%和13.8%。由于PPO和POD可將酚類物質氧化為顏色更深的醌類物質，GB處理顯著抑制枇杷果心褐變的發生，這與GB抑制了PPO和POD活性有關。

圖5 GB處理對枇杷果實PPO（A）和POD（B）活性的影響Fig.5 Effect of GB treatment on polyphenol oxidase activity (A) and peroxidase activity (B) in cold-stored loquat fruits

2.7 GB處理對枇杷果實總酚和總黃酮含量的影響

圖6 GB處理對枇杷果實總酚含量（A）和總黃酮含量（B）的影響Fig.6 Effect of GB treatment on the contents of total phenolics (A) and total flavonoids (B) in cold-stored loquat fruits

由圖6可以看出，枇杷果實的總酚和總黃酮含量隨著貯藏時間的延長而逐漸下降。GB處理能顯著抑制總酚和總黃酮含量的降低（P＜0.05）。在貯藏第3周和5周，GB處理組的枇杷果實中總酚含量分別比對照組果實高9.8%和12.7%，總黃酮含量分別比對照組果實高10.4%和13.7%。這表明GB處理能保持枇杷果實中較高的抗氧化物質含量，對于提高枇杷果實的營養品質有積極作用。

3 討 論

枇杷屬于冷敏性水果，低溫貯藏時果實組織易發生冷害，果心褐變是枇杷典型的冷害癥狀。研究采后處理技術提高枇杷果實對低溫環境的抗性是近年來國內外保鮮技術領域的熱點。GB作為細胞中重要的滲透調節物質，能提高植物對低溫、干旱、高鹽等逆境的抗性[3]。在黃瓜果實的研究中發現，外源GB可減輕黃瓜果實的冷害，增強脯氨酸的積累[4]。本研究表明采后GB處理能降低枇杷果實果心褐變發生，保持較好的采后品質。

果蔬組織內具有抗氧化酶體系，能減少O2－·和H2O2等活性氧的大量積累。CAT專一地作用于H2O2，將H2O2分解為水或氧氣；APX能夠經抗壞血酸-谷胱甘肽循環將H2O2分解為水分子[16]，提高細胞抗氧化系統的還原勢，從而減輕H2O2對植物造成的氧化傷害；而SOD能通過歧化反應清除O2－·，減少活性氧對細胞膜系統的傷害，這3種酶協調作用，使果實組織中的活性氧代謝保持在平衡狀態。已研究證實采后熱處理能提高枇杷果實抗氧化酶的活性，可以有效減少冷害的發生[17]。本研究結果表明，GB處理能保持枇杷果實較高的CAT和APX活性，減少活性氧自由基的含量。PPO和POD能氧化酚類物質，主要參與果蔬冷藏期間的褐變。Cai Chong等[18]報道低溫預貯可抑制枇杷果實PPO活性，減輕果肉褐變。本研究發現GB處理抑制了枇杷果實PPO和POD活性，這與減輕冷害癥狀密切相關。

在低溫條件的脅迫下，冷敏果實細胞膜首先響應低溫脅迫，同時果肉組織發生的活性氧自由基積累，加劇細胞膜脂質過氧化作用。活性氧自由基能造成細胞質膜系統損傷，使細胞膜區域化遭到破壞，膜透性上升，膜脂過氧化產物MDA大量積累[19]。GB可調節細胞滲透勢、保持細胞膨壓的作用，可以與細胞膜水化層結合，穩定細胞膜的完整性和蛋白質復合物的四級結構[3]。已有研究表明，GB處理能提高草莓[20]和黃瓜[21]幼苗的抗冷性，維持活性氧代謝和滲透壓平衡，減少對細胞膜的傷害。蘇文潘等[22]研究表明7.5 mmol/L的GB處理能有效延緩香蕉幼苗膜透性的增加。Hayashi等[23]也發現在擬南芥種子的發芽培養基上添加5 mmol/L的GB能減輕低溫對其生長的不良影響。此外，GB處理能夠提高玉米葉片中可溶性蛋白的含量，增強組織的抗氧化防御作用，減少低溫脅迫下氧化損傷導致的冷害[24-25]。本研究發現GB處理能夠降低枇杷果實細胞膜滲透率，抑制MDA的積累，這表明GB對維持枇杷果實采后細胞膜的完整性和穩定性具有積極作用，GB通過保護細胞膜結構減輕枇杷果實采后冷害發生。這與王富貴等[26]報道的外源GB抑制黃瓜低溫貯藏期間MDA積累的結論相似。這些結果說明采后GB處理主要通過提高枇杷果實冷藏期間抗氧化酶活性，減少活性氧自由基積累，保護細胞膜完整性，延緩膜脂過氧化作用，從而減輕果實的冷害癥狀。

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