烯酰嗎啉在人參和土壤中的殘留動態及膳食風險評估

王 燕，王春偉,，高 潔,*，崔麗麗

（1.吉林農業大學農學院，吉林 長春 130118；2.中國農業科學院特產研究所，吉林 長春 130112）

烯酰嗎啉即4-[3-（4-氯苯基）-3-（3,4-二甲氧基苯基）丙烯酰]嗎啉，是一種肉桂酸衍生物，為專一殺卵菌綱真菌殺菌劑，其作用機制是破壞病菌細胞壁膜的形成，引起孢子囊壁的分解使病菌死亡，可用于防治多種作物霜霉屬和疫霉屬病菌引起的病害[1-2]。人參疫病是由卵菌門疫霉屬惡疫霉菌（Phytophthora cactorum）侵染所致[3]，該病在人參產區分布廣泛，是人參生育期內最嚴重的病害之一，可發生多次再侵染，嚴重時發病率可達70%以上，造成參苗大面積受害死亡[4]。目前烯酰嗎啉已廣泛用于人參疫病的防治，且與甲霜靈、苯霜靈等苯基酰胺類殺菌劑無交互抗性[5]。

近年來，歐盟、美國、日本等國家和地區相繼制定了越來越嚴格的食品安全法規和農藥殘留限量標準，農藥殘留問題已成為我國包括人參在內的眾多農產品出口受阻的主要原因。烯酰嗎啉殘留量的檢測方法主要有氣相色譜法[2,6-8]、液相色譜法[9]、氣相色譜-質譜法[10-13]、液相色譜-質譜法[14-17]等，而采用高效液相色譜-質譜法測定人參中烯酰嗎啉的殘留動態及最終殘留量，并對其可能產生的膳食安全風險進行評估，國內外未見報道。

人參基質成分復雜，包括多種皂甙、有機酸、多糖等，若采用傳統色譜分析手段，其樣品凈化困難，在檢測過程中易產生假陽性。高效液相色譜-質譜（high performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry，HPLC-MS-MS）是以質譜儀為檢測手段，集高效液相色譜高分離能力與質譜高靈敏度和高選擇性于一體的分離分析方法，具有靈敏度高、廣譜性強、抗干擾好等優點，可利用色譜保留時間和質譜特征離子對及其相對豐度比等多重因素進行準確定性，與傳統的色譜分析方法相比，定量測定結果更加準確、陽性結果確證更加可靠。本實驗根據人參樣品基質的特性，對提取、凈化等前處理步驟進行了優化，建立了人參根、莖、葉和土壤中烯酰嗎啉的高效液相色譜-質譜檢測方法，研究烯酰嗎啉在人參根、莖、葉及土壤中的消解動態及最終殘留量，并對其可能產生的膳食安全風險進行評估，為烯酰嗎啉在人參上的安全合理使用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試農藥：質量分數80%的烯酰嗎啉水分散粒劑陜西標正作物科學有限公司；供試作物：4 年生人參，品種為大馬牙，試驗地點：吉林省撫松縣興參鎮榆樹村人參種植基地和集安市榆林鎮大地參業人參種植基地。

甲苯、丙酮、乙腈（優級純） 美國Tedia公司；甲酸（色譜純） 天津科密歐化學試劑有限公司；烯酰嗎啉標準物質（純度為99.0%） 國家標準物質信息中心；ProElut人參農藥殘留（ginseng pesticides residue，GPR，粒徑1.5 g/12 mL）固相萃取柱 北京Dikma公司。

1.2 儀器與設備

API 4000三重四極桿液質聯用儀 美國AB公司；1200高效液相色譜儀 美國Agilent公司；Kromasil Eternity-5-C18色譜柱 瑞典Akzo Nobel公司；R-210旋轉蒸發儀 瑞士Büchi公司；X-22R離心機（10 000 r/min）美國Beckman Coulter有限公司；Vortex.Genie 2渦旋混勻器 德國IKA公司；LC51-GM200刀式混合碾磨儀（10 000 r/min） 德國Retsch公司；Milli-QA10超純水器 美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 田間試驗設計

消解動態試驗共設高劑量和不施藥空白對照2個處理，3次重復，小區面積為15 m2。施藥時期為人參展葉后期，2012年7月31日。施藥劑量為800 g a.i./hm2。施藥后0（施藥后2 h之內）、1、3、7、14、21、28 d和35 d分別采集人參根、莖、葉及土壤樣品，每小區按對角線取5 點，土壤樣品取土深度為0～10 cm。

最終殘留實驗共設低劑量、高劑量和不施藥空白對照3個處理，施藥劑量分別為800 g a.i./hm2和533.33 g a.i./hm2，設3次重復，小區面積為15 m2，在施藥后28、35 d和60 d采集人參根、莖、葉和土壤樣品，每小區按對角線取5 點，土壤樣品取土深度為0～15 cm。

采樣方法：每小區按對角線取5 點，土壤樣品取土深度為0～10 cm，四分法留樣。同期采集空白樣品，標簽標記后于－20℃條件下保存待測[18]。

1.3.2 樣品前處理

樣品的制備：稱取鮮人參根、莖、葉樣品各100 g，依次用混合碾磨儀將樣品粉碎后，于－20℃保存備用。取土壤樣品不少于200 g，過0.25 mm孔徑篩，混勻，于－20℃保存備用。

提取：分別準確稱取5 g人參根、莖、葉及土壤樣品置于50 mL離心管中，加入20 mL丙酮后用渦旋混勻器混合1 min，8 000 r/min離心5 min，取上清液，再向離心管中加入20 mL丙酮，重復提取一次，合并上清液于35℃條件下旋轉蒸發至近干，加入乙腈-甲苯（3∶1，V/V）5 mL溶解，待凈化。

凈化：10 mL乙腈-甲苯（3∶1，V/V）預淋洗GPR固相萃取柱，流出液棄去。將5 mL樣品提取溶解液傾入GPR固相萃取柱中，用20 mL乙腈-甲苯（3∶1，V/V）進行洗脫。收集全部洗脫液于雞心瓶中，于35℃水浴中旋轉濃縮至近干。用乙腈溶解，并定容至1 mL，經0.22 μm濾膜過濾后供LC-MS-MS測定。

1.3.3 儀器條件

色譜柱：Kromasil Eternity-5-C18柱（2.1 mm×150 mm，0.5 μm）；流動相：V（乙腈）∶V（水）∶V（甲酸）=90.00∶9.99∶0.01；流速250 μL/min；柱溫度40℃；進樣量10 μL。

電離方式為電噴霧電離（electron spray ionization，ESI）源；電噴霧電壓5 500 V；霧化氣壓力0.483 MPa；氣簾氣壓力0.138 MPa；輔助加熱氣壓力0.379 MPa；離子源溫度725℃；掃描方式為正離子掃描；檢測方式為多反應監測。

1.3.4 標準曲線制作

準確稱取烯酰嗎啉標準品，置于100.0 mL容量瓶中，用丙酮配制成質量濃度100 μg/mL的標準儲備液，用人參空白基質液稀釋、定容，配制成質量濃度為0.001、0.005、0.01、0.05、0.10 μg/mL的標準溶液，以質量濃度為橫坐標（x），峰面積為縱坐標（y），建立標準曲線，得線性回歸方程和相關系數。

1.3.5 烯酰嗎啉在人參中的膳食風險評估

依照所建立的方法對人參樣品中烯酰嗎啉的殘留量進行檢測，其膳食風險評估結果分別由公式（1）和（2）[19]計算得出：

楊大進等[20]經調查得出我國60 kg體質量成人的中藥材保健食品每日攝入量約為0.000 57 kg，烯酰嗎啉每日允許攝入量（acceptable daily intake，ADI）值為0.20 mg/kg bw[21]，理論殘留量以2地實驗高劑量下人參根中最終殘留量的平均值計，以人均體質量60 kg計，計算烯酰嗎啉在人參上的估計暴露量和風險商值。

當風險商值大于1時，表示存在不可接受的風險，數值越大，風險越大；風險商值小于1時，表示風險為可以接受，數值越小，風險越小[19]。

2 結果與分析

2.1 提取條件的選擇

本研究采用極性較強的有機溶劑提取，以丙酮、乙腈、甲醇作為提取溶劑進行選擇實驗。其中，甲醇做提取劑時，乳化現象嚴重，8 000 r/min 離心10 min仍不能消除乳化現象，因此重點考察了丙酮和乙腈的提取效果。研究發現，2種提取溶劑中，丙酮提取效率為92.0%，乙腈為81.5%，丙酮對烯酰嗎啉的提取效率明顯高于乙腈，故用丙酮提取。

2.2 凈化條件的選擇

采用目前殘留檢測中應用最廣泛的固相萃取（solid phase extraction，SPE）法。SPE法所需樣品量少，避免了乳化現象，且回收率高、重復性好。實驗過程中選擇GPR固相萃取柱，乙二胺-N-丙基硅烷（primary secondary amine，PSA）固相萃取柱，活性碳固相萃取柱，弗羅里硅土柱和十八烷基硅烷鍵合相（C18）固相萃取柱進行凈化。結果表明，烯酰嗎啉采用GPR固相萃取柱凈化效果最好（表1）。

表1 不同SPE柱中的烯酰嗎啉回收率Table1 Effects of different solid phase extraction cartridges on the recovery of dimethomorph

2.3 洗脫溶劑體積的選擇

洗脫溶劑體積直接影響目標分析物能否被洗脫下來。圖1為乙腈-甲苯（3∶1，V/V）洗脫的洗脫曲線圖，從洗脫曲線可知：烯酰嗎啉在GPR固相萃取柱上在0～18 mL時流出。因此，本方法確定收集20 mL洗脫液則可最大程度地除去基質干擾物的同時保證農藥組分的回收率符合農藥殘留檢測的要求。

圖1 乙腈-甲苯洗脫曲線圖Fig.1 Cumulative recovery of dimethomorph eluted by acetonitrile/methylbenzene

2.4 色譜條件的優化

同一樣品在不同填料的色譜柱上分離效果不同，通過對安捷倫公司、迪馬公司、沃特斯等公司生產的不同型號的C18色譜柱進行對比，最終選擇瑞典AKZO NOBEL公司生產的Kromasil Eternity-5-C18色譜柱。Kromasil是一種高純度球形硅膠填料，含碳量高，表面極性小，分離效能高，能有效降低金屬螯合物在硅膠基質上的絡合效應，具有重復性好，適用性廣，使用壽命長的特點。另外，流動相的組成不僅會影響到目標化合物的保留時間和峰形，還會影響到離子化效率，從而影響靈敏度。選擇流動相為乙腈-水或甲醇-水進行比較，實驗發現，以乙腈和水為流動相各信號響應強度優于甲醇，所以選用乙腈和水來做為流動相。甲酸的加入利于目標物的質子化，因而可以提高靈敏度，但過量甲酸的加入則會反過來抑制目標物的質子化，進而降低靈敏度。實驗優化了甲酸的加入量，結果表明，流動相為V（乙腈）∶V（水）∶V（甲酸）=90.00∶9.99∶0.01時效果最好，色譜峰對稱尖銳，峰形良好。

2.5 質譜條件的優化

采用流動注射泵連續進樣方式進行質譜條件的優化，在ESI正離子模式下進行全掃描，確定母離子后，優化去簇電壓，再進行子離子掃描，同時優化碰撞氣能量，根據歐盟2002/657/EC指令對殘留確認方法的要求，對于高效液相色譜-質譜，至少需要一個母離子和兩個子離子才能定性確證。選擇離子豐度較強、干擾較小的兩個子離子，進行多反應監測（multiple reaction monitoring，MRM），并對質譜參數進行優化（表2）。

表2 質譜優化參數Table2 Optimized MS parameters

2.6 樣品基質效應的消除

電噴霧離子源易受樣品基質影響，樣品基質對離子化可能存在抑制作用。為消除樣品基質效應，本研究分別以人參根、莖、葉及土壤的空白樣品提取液配制不同質量濃度的標準溶液，用來定量測定人參根、莖、葉和土壤中烯酰嗎啉殘留量，以保證標準溶液和樣品溶液具有同樣的離子化條件，從而消除樣品基質效應。

2.7 線性范圍及最低檢出限

烯酰嗎啉在0.001～0.10 μg/mL質量濃度范圍內，以質量濃度為橫坐標（x），峰面積為縱坐標（y），得到線性方程為y=3.05×103x+1.05×104，R2=0.999 9。在所設定的儀器條件下，以3倍信噪比（RSN=3）計算檢出限，烯酰嗎啉的最低檢出限為0.001 mg/kg。

2.8 添加回收率測定

表3 烯酰嗎啉的添加回收率（n=10）Table3 Recoveries of dimethomorph (n= 10)

在0.01～0.20 mg/kg添加范圍內，烯酰嗎啉在人參根、莖、葉及土壤中的添加回收率分別82.4%～95.5%、82.0%～95.1%、88.1%～91.3%、87.1%～93.4%，相對標準偏差分別為5.01%～7.66%、5.05%～6.18%、5.85%～7.67%、5.39%～6.26%，結果見表3，符合殘留實驗要求。烯酰嗎啉標準品MRM色譜圖（0.01 mg/kg），人參空白樣品MRM色譜圖和人參添加樣品MRM色譜圖（0.01 mg/kg）分別見圖2～4。

圖2 烯酰嗎啉標準品MRM色譜圖（0.01 mg/kg）Fig.2 MRM chromatogram of dimethomorph standard (0.01 mg/kg)

圖3 人參空白樣品MRM色譜圖Fig.3 MRM chromatogram of ginseng blank samples

圖4 人參添加樣品MRM色譜圖（0.01 mg/kg）Fig.4 MRM chromatogram of spiked ginseng sample (0.01 mg/kg)

2.9 殘留動態實驗

由表4可知，通過在集安市和撫松縣兩地進行的殘留動態實驗，質量分數80%的烯酰嗎啉水分散粒劑在人參根、莖、葉和土壤中的降解動態符合一級反應動力學方程Ct=C0e－Kt。式中：Ct為施藥后間隔時間t時農藥質量分數；C0為施藥后的原始沉積量；K為降解速率常數；t為施藥后的時間。由此可求出降解半衰期t1/2=ln2·K－1。烯酰嗎啉的原始沉積量從大到小依次為葉＞莖＞土壤＞根，在人參的根、莖、葉及土壤中的半衰期均在9.13～16.35 d之間，半衰期較短，屬于易降解農藥（t1/2＜30 d）。

表4 烯酰嗎啉在人參根、莖、葉和土壤中消解動力學參數Table4 Kinetic degradation parameters of dimethomorph in ginseng root, stem, leaf and soil

2.10 最終殘留實驗

表5 烯酰嗎啉在人參根、莖、葉及土壤中的最終殘留Table5 Final residues of dimethomorph in ginseng root, stem, leaf and soil mg/kg

由表5可知，通過在集安市和撫松縣兩地進行的最終殘留實驗，施藥后28、35、60 d烯酰嗎啉在人參根、莖、葉和土壤中的殘留量分別為未檢出～0.024 5、0.023 3～0.138 7、0.121 5～0.618 2 mg/kg和0.008 4～0.073 8 mg/kg。

2.11 烯酰嗎啉在人參中的膳食風險評估

質量分數80%的烯酰嗎啉水分散粒劑在人參中估計暴露量為7.13×10－8mg/kg，風險商值為3.56×10－7（遠小于1），在施藥劑量為533.33～800 g a.i./hm2，在一個生長季節施用1次，膳食風險較低，對消費者安全。

3 結 論

本研究建立了人參根、莖、葉及土壤中烯酰嗎啉的高效液相色譜-質譜檢測方法。該方法操作簡便、快捷，具有較好的精密度、靈敏度、準確度，完全滿足農藥殘留檢測要求。殘留動態實驗結果表明：烯酰嗎啉在人參根、莖、葉和土壤中的降解半衰期為9.13～16.35 d，屬于易降解農藥（t1/2＜30 d）。

我國尚未制定烯酰嗎啉在人參中的最大殘留限量標準，歐盟規定烯酰嗎啉在人參上的最大殘留限量值為0.05 mg/kg[22]，韓國規定烯酰嗎啉在鮮人參和干人參中的最大殘留限量值分別為3.00 mg/kg和15.00 mg/kg[23]，我國規定烯酰嗎啉在蔬菜和水果中的最大殘留限量值為0.05～5.00 mg/kg[20]。參照以上殘留限量規定及殘留實驗數據，建議質量分數80%的烯酰嗎啉水分散粒劑在人參上的最大殘留限量值可暫定為0.05 mg/kg，安全間隔期為28 d。質量分數80%的烯酰嗎啉水分散粒劑在人參生長期施藥1次，施藥量為800 g a.i./hm2時，風險商值為3.56×10－7（遠小于1），膳食風險較低，人參在收獲后入藥及食用是安全的。

[1]劉君麗, 陳亮, 孟玲.疫霉病害的發生與化學防治研究進展[J].農藥,2003, 42(4): 13-16.

[2]王巖, 姚威風, 梁爽, 等.甘藍和土壤中吡唑醚菌酯·烯酰嗎啉殘留分析[J].農藥, 2011, 50(1): 46-47; 57.

[3]趙曰豐, 吳連舉, 楊依軍, 等.人參疫菌病原菌的研究[J].植物病理學報, 1993, 23(10): 260.

[4]李玉.植物病理學[M].長春: 吉林科學技術出版社, 1992: 115.

[5]崔淑華, 王開運, 錢家亮, 等.烯酰嗎啉在大蔥中的殘留消解動態[J].農藥, 2010, 49(1): 47-52.

[6]徐偉松, 李暢方, 何強, 等.烯酰嗎啉在黃瓜和土壤中的殘留量及消解動態研究[J].農藥科學與管理, 2008, 29(3): 15-18.

[7]范東升.烯酰嗎啉在葡萄上的殘留及消解動態[J].農藥, 2009, 48(9):35-38.

[8]LIANG Hongwu, LI Li, LI Wei, et al.Dissipation and residue of dimethomorph in pepper and soil under field conditions[J].Ecotoxicology and Environmental Safety, 2011, 74(5): 1331-1335.

[9]李二虎, 胡敏, 吳兵兵, 等.高效液相色譜法測定黃瓜中烯酰嗎啉和腈菌唑農藥殘留[J].現代農藥, 2007, 6(4): 38-40.

[10]宋國春, 于建壘, 李瑞娟, 等.烯酰嗎啉在黃瓜中的殘留消解動態[J].中國蔬菜, 2006(11): 23-24.

[11]HENGEL M J, SHIBAMOTO T.Gas chromatographic-mass spectrometric method for the analysis of dimethomorph fungicide in dried hops[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2000,48(12): 5824-5828.

[12]?U? F, ?ESNIK H B, BOLTA ? V, et al.Pesticide residues in grapes and during vinification process[J].Food Control, 2010, 21(11): 1512-1518.

[13]DALVIE M A, SOSAN M B, AFRICA A, et al.Environmental monitoring of pesticide residues from farms at a neighbouring primary and pre-school in the western cape in south Africa[J].Science of the Total Environment, 2014, 466/467: 1078-1084.

[14]LIU Congyun, WAN Kai, HUANG Jianxiang, et al.Behavior of mixed formulation of metalaxyl and dimethomorph in grape and soil under field conditions[J].Ecotoxicology and Environmental Safety, 2012,84(1): 112-116.

[15]ARIENZO M, CATALDO D, FERRARA L, et al.Pesticide residues in fresh-cut vegetables from integrated pest management by ultra performance liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry[J].Food Control, 2013, 31(1): 108-115.

[16]MAYER-HELM B, HOFBAUER L, MULLER J.Method development for the determination of selected pesticides on tobacco by high-performance liquid chromatography-electrospray ionisationtandem mass spectrometry[J].Talanta, 2008, 15(5): 1184-1190.

[17]HASHI M, KITAGAWA Y, AKUTSU K, et al.Determination of seventeen pesticide residues in agricultural products by LC/MS[J].Journal of the Food Hygienic Society of Japan, 2002, 43(6): 389-393.

[18]劉光學.NY/T 788—2004 農藥殘留試驗準則[S].北京: 中國農業出版社, 2004.

[19]中國農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所.農產品質量安全風險評估: 原理、方法和應用[M].北京:人民衛生出版社, 2008:232-233.

[20]楊大進, 王竹天, 宋書鋒, 等.中藥材類保健食品中添加劑限量標準研制[J].中國公共衛生, 2008, 24(3): 358-359.

[21]衛生部, 農業部.GB 2763—2012 食品安全國家標準食品中農藥最大殘留限量[S].北京: 中國標準出版社, 2012.

[22]European Commission.Pesticide EU-MRLs regulation (EC) No.396/2005[EB/OL].Brussels: European Commission, 2005.http://ec.europa.eu/food/plant/ pesticides/ max_residue_levels/eu_rules_en.htm.

[23]Ministry of Food and Drug Safety.MRLs for pesticides in foods:history of establishment of pesticide MRLs in Korea[EB/OL].Seoul:Ministry of Food and Drug Safety, 2012.http://www.kfda.go.kr/cgibin/t4.cgi/ eng/english_12.taf.