新生SD大鼠心肌細胞的原代培養及熒光鑒定

姬婷婷，徐 巖，張建華，趙 勇

心肌細胞原代培養是指在體外適宜的條件下使心肌細胞生長，并保留一定的結構和功能特性。其作為一種體外實驗研究模型，已應用于許多研究，如細胞凋亡、缺氧缺血再灌注模型等，培養技術及方法的不同導致新生大鼠心肌細胞原代培養效果差異較大，因此建立一種簡單、穩定、有效的培養方法是必要的。該研究參照Golden et al［1］的原代心肌細胞培養方法并加以改進，形成一種簡單、穩定、有效的方法，為心肌細胞體外培養提供了有效的技術手段。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 選擇1～3日齡健康SD大鼠10～15只，清潔級，雌雄不限，由安徽醫科大學實驗動物中心提供。

1.1.2 主要試劑 高糖 DMEM、胎牛血清(美國Hyclone公司);胰蛋白酶(美國Invitrogen公司);兔抗大鼠肌鈣蛋白Ⅰ多克隆抗體(英國Abcam公司);小鼠抗大鼠α-Sarcomeric actin單克隆抗體(北京博士德公司);FITC標記山羊抗兔IgG抗體、FITC標記山羊抗小鼠IgG抗體、山羊封閉血清(北京中杉金橋生物技術有限公司);Triton X-100、臺盼藍(美國Sigma公司);DAPI染色液(碧云天公司);D-Hank液等自行配置。

1.1.3 實驗儀器 ZHJH-C1112B超凈工作臺(上海智城公司);SMART Cell CO2培養箱(Heal Force公司);C-MAG HS7恒溫磁力攪拌器(IKA公司);XDS-1B光學顯微鏡(IC公司);Nikon ECLIPSE 80i免疫熒光顯微鏡(新飛達光學儀器公司);離心機、離心管、吸管、眼科剪、眼科鑷等由本實驗室提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 組織消化和細胞分離 配制0.1%胰酶DHank緩沖液，過濾除菌備用;恒溫磁力攪拌器預熱至35～37℃、轉速80～100 r/min;取出生1～3日齡健康新生SD大鼠，無菌條件下眼科剪剪取乳鼠心室，置于D-Hank緩沖液中清洗并剔除心臟上的結締組織及血塊，再用D-Hank緩沖液清洗1次，去除血細胞;將漂洗后的心肌組織在少量D-Hank緩沖液中用眼科剪剪成約1 mm3的小塊，轉移至100 ml無菌錐形瓶中，靜止1 min棄上清液，然后加入10 ml 0.1%的胰酶，吸管將心肌組織打散，放入攪拌子，37℃水浴中磁力攪拌器分次消化。首次與第2次消化10 min后的消化液丟棄(主要含紅細胞);重新加入0.1%胰酶15 ml，消化15 min，隨后收集每次消化的細胞懸液，收集的細胞懸液應及時采用含有10%胎牛血清的培養基終止胰蛋白酶的作用。重復上述消化、收集細胞、終止消化等步驟6～7次，直至組織變白。

1.2.2 心肌細胞純化和培養 將收集的細胞懸液800 r/min離心5 min，棄上清液，用含10%胎牛血清的DMEM培養基重懸細胞，并將細胞懸液過濾后轉移至培養瓶中，置于含5%CO2細胞培養箱中37℃培養1 h后，將未貼壁的細胞懸液轉移至另一培養瓶，繼續培養1 h后，將未貼壁的細胞懸液轉移至離心管中，臺盼藍染色法檢測細胞成活率。細胞計數后，用含10%胎牛血清的DMEM培養基將細胞密度調整至3×105/ml，并接種于6孔培養板中，置于含5%CO2細胞培養箱中37℃培養。24 h左右光學顯微鏡下可見心肌細胞節律性收縮，換液去除未貼壁的細胞懸液，更換新鮮培養基。

1.2.3 臺盼藍染色法檢測心肌細胞成活率 取0.5 ml 0.4%臺盼藍染色液、0.3 ml磷酸鹽緩沖液(PBS，0.01 mol/L，pH 7.2)和0.2 ml吹打均勻的心肌細胞懸液，充分混勻，混合液放置5～10 min，吸管滴少量混合液入計數板。顯微鏡下計數活細胞數。正常細胞不被染色，呈透明、折光性強的細胞，細胞死亡后細胞膜通透性增大，臺盼藍進入細胞內，細胞呈藍色。細胞成活率(%)=(總細胞數－著色細胞數)/總細胞數×100%。

1.2.4 免疫熒光染色法鑒定心肌細胞純度 取培養48 h已爬片心肌細胞，用PBS輕輕沖洗1次;冷75%乙醇溶液固定15 min，PBS洗3次;加 0.3%Triton X-100通透30 min，PBS洗3次;山羊血清室溫封閉60 min;1∶200稀釋的兔抗大鼠心肌肌鈣蛋白Ⅰ多克隆抗體(1∶50稀釋的小鼠抗大鼠α-Sarcomeric actin單克隆抗體)于4℃過夜(陰性對照用PBS代替)，PBS洗3次;l∶100稀釋的山羊抗兔IgG抗體(1∶50稀釋的山羊抗小鼠IgG)孵育1 h;加DAPI染色液孵育10 min，PBS洗3次;抗熒光淬滅液封片后立即倒置熒光顯微鏡下觀察，每個蓋玻片隨機選擇8個視野，拍照后分析心肌細胞純度。

2 結果

2.1 心肌細胞形態學觀察 普通光學顯微鏡觀察顯示，剛分離的心肌細胞呈圓形，培養3～5 h細胞開始貼壁生長，呈圓形，后變為梭形，細胞逐漸展開，伸出偽足，變為多邊形、不規則等形態;24 h后細胞基本貼壁，多數貼壁的單個細胞出現自發性搏動，搏動頻率和節律不同，細胞生長密度可達到板底的80%;48 h后伸出偽足相互接觸交織成網，搏動趨于同步性;72 h后會逐漸形成細胞簇并出現同步搏動，形成功能性合胞體細胞，見圖1。

2.2 心肌細胞成活率檢測 臺盼藍染色可見分離細胞成活率達90%以上。

2.3 心肌細胞純度鑒定 培養48 h的心肌細胞經肌鈣蛋白Ⅰ多克隆抗體、α-Sarcomeric actin單克隆抗體免疫熒光染色后，于倒置熒光顯微鏡下觀察可見肌鈣蛋白Ⅰ多克隆抗體(綠色熒光，位于細胞質)表達陽性率達98%以上，α-Sarcomeric actin單克隆抗體(綠色熒光，位于細胞質)表達陽性率達98%以上，見圖1，DAPI染色的細胞核呈藍色熒光，而陰性對照無熒光呈現。

圖1 原代培養的新生SD大鼠心肌細胞 ×400

3 討論

新生大鼠心肌細胞分離以往常采用胰蛋白酶聯合膠原酶消化法進行分離［1－2］，但該研究經多次實驗發現單用0.1%胰蛋白酶(不含EDTA)消化分離細胞，避免用膠原酶消化對心肌細胞造成損傷，使分離細胞的存活率高達90%，同時降低了實驗成本。采用恒溫磁力攪拌器分次消化細胞，轉速80～100 r/min，溫度35～36℃，避免既往用吸管反復吹打消化法對心肌細胞造成的機械損傷，提高消化效率，縮短消化時間，降低細胞膜受損程度，提高細胞獲得率及存活率。采用兩次差速貼壁法純化心肌細胞，心肌細胞純化方法有差速貼壁法［3］和化學試劑抑制法［4］，差速貼壁法是根據心肌細胞和成纖維細胞在培養器皿表面貼壁生長的速度不同而純化心肌細胞，其對心肌細胞無損傷;化學試劑抑制法是利用特定的化學物質抑制生長活躍的成纖維細胞增殖，即在培養基中加入有絲分裂抑制劑如阿糖胞苷、5-溴脫氧尿苷等抑制心肌成纖維細胞DNA合成或蛋白質合成，但有文獻［4］報道認為其對心肌細胞有損傷;兩次差速貼壁后培養48 h，經肌鈣蛋白Ⅰ多克隆抗體和α-Sarcomeric actin單克隆抗體鑒定，心肌細胞的純度高達98%，在不損傷和影響心肌細胞生長的同時，也提高了心肌細胞純度。細胞接種密度控制在2.5 ×105～5 ×105/ml［5］，培養 24 h 后細胞生長密度可達到板底的80%，避免細胞接種過多發生營養不良或細胞接種過少導致心肌細胞間無法進行信息交流。此外，取材過程嚴格無菌操作、移取心臟迅速、熟練掌握實驗操作流程等縮短心肌細胞缺氧缺血時間，提高了細胞的存活率。

［1］Golden H B，Gollapudi D，Gerilechaogetu F，et al.Isolation of cardiac myocytes and fibroblasts from neonatal rat pups［J］.Methods Mol Biol，2012，843:205 －14.

［2］張乃菊，陳天平，祝曉光.乳鼠心肌細胞和心臟成纖維細胞的原代培養［J］.蚌埠醫學院學報，2010，35(6):558－61.

［3］Zhang Z Y，Liu X H，Hu W C，et al.The calcineurin－myocyte enhancer factor 2c pathway mediates cardiac hypertrophy induced by endoplasmic reticulum stress in neonatal rat cardiomyocytes［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2010，298(5):H1499 －509.

［4］Wu L X，Gu X F，Zhu Y C，et al.Protective effects of novel single compound，Hirsutine on hypoxic neonatal rat cardiomyocytes［J］.Eur J Pharmacol，2011，650(1):290 － 7.

［5］Prasad A M，Inesi G.Analysis of Calcium transients in cardiac myocytes and assessment of the sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase contribution［J］.Methods Mol Biol，2012，798:411 －21.