大黃湯劑蒽醌類成分測定及其在顱腦損傷中的應用

于宗光

山東省即墨市第二人民醫院神經外科，山東即墨 266214

大黃屬于科類植物，其中包含了蒽醌類以及苯丁酮類等成分，在臨床使用中具有抗菌、消炎等功效。臨床多采用大黃用于中藥制劑中。關于大黃蒽醌類成分的測定臨床上采用的方法也比較多，諸如比色法、高效液相法以及毛細管電脈法等等。大黃具有的活血化瘀以及泄熱等功效是治療顱腦損傷的一個綜合應用。因而，大黃以及大黃中的有效成分是治療顱腦損傷的藥效學指標[1]。

顱腦損傷是指頭部在受到外力而導致的損傷[2]。顱腦損傷在中青年中的致死和致殘率十分高，對于嚴重者的治療通常是以防治全腦缺血為主。在治療顱腦損傷的過程中，通過降低顱內壓以及改善腦血流是治療的主要機制。當前，對顱腦損傷較為有效的治療還處于實驗室階段，臨床上對此類疾病的治療研究并不理想。從中醫的角度來說，顱腦損傷導致的昏迷的病機是外傷致使鬧脈絡破裂，血溢出脈外導致積而成淤而致使患者昏迷不醒。

本次研究通過對大黃湯劑中的蒽醌類成分進行測定，探索其在顱腦損傷中的應用，并分析其抗氧化藥理功效[1]。確定可吸收的作用于顱腦中的有效成分，為提高中藥質量研究提供參考，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取我院2013年6月—2014年1月收取的70例創傷性顱腦損傷患者在通過鼻飼大黃湯劑后實施腰椎穿刺手術，采用以上方法對患者的腦脊液進行檢測。70例顱腦損傷患者有不同程度的損傷，患者年齡在20～45歲之間，其中有男性患者39例，女性患者31例。

然后把檢測出的蒽醌類成分在動物中進行實驗，使用20只實驗鼠進行對比治療。實驗鼠分為治療組和對照組，治療組實驗鼠給予大黃素甲醚灌胃，對照組給予生理鹽水灌胃[2]。灌胃24 h后取上實驗鼠腦皮質，通過經胺法檢測大鼠腦皮質SOD活力。

1.2 方法

1.2.1 大黃湯劑蒽醌類成分測定 材料與儀器：使用美國某公司生產的Waters Acquity高效液相色譜儀器。儀器構成為二元泵處理器、柱溫箱以及樣品處理器等；生大黃：于中藥房購買生大黃，樣品存于藥理實驗室[3]。

色譜條件：色譜柱為2.0×100mm,1.6um，色譜柱溫控制在四十攝氏度，探測波長控制在255納米，進樣量為4uL[4]。

試品溶液的制備：為了確保定量的準確性，通過量杯進行定量，取30 g的生大黃，處理干凈后研磨成粉末在蒸餾水中浸泡半個小時，然后煎煮沸騰20 min。待其冷卻之后加以過濾，文火上濃縮成含有大黃生藥的藥液。

對照品溶液的制備：精密稱定適量的番瀉苷A、B，蘆薈大黃素、大黃素等，使用甲醇溶解定容到30 mL的瓶中進行數分鐘的搖勻。搖勻后可得一定濃度的溶液，分別取溶液對照品放入20 mL的瓶中，并且加入些許甲醇進行稀釋到刻度。

標準曲線的制備：精密吸取一定量的對照溶液，同時加入甲醇進行稀釋制成標準品溶液，根據以上的色譜條件對各樣3uL測定。

1.2.2 實驗鼠大黃素甲醚抗氧測定 材料與儀器：取SOD試劑盒，常州萬泰有限公司的電子分析天平，北京優尼康生物公司的微量勻漿儀[5]。

試驗方法：20只大鼠，雌雄大鼠分別10只，大鼠年齡為3～5個月，重量為260～320 g。兩組大鼠經過麻醉后俯臥于手術臺，對其左腦進行開顱手術，在前臼后側的1.5 mm，左側2 mm處開骨窗，直徑為0.6里面。使用重錘對骨窗進行自由落體的沖擊，沖擊力控制在1000g.cm，然后使用骨蠟封閉大鼠骨窗。大鼠蘇醒后對對照組進行生理鹽水灌胃，治療組使用大黃素加密灌胃，灌量保持一致。

腦組織超氧化物測定：灌胃后的24 h在對大鼠麻醉后處死，取大鼠頭部進行清洗，去除血液使用濾紙拭干并且進行稱重，取200 mg的腦皮層組織當放入2 mL的勻漿介質中，然后使用勻漿器進行勻漿，取上清液測定器SOD活性。

1.3 納入標準

對顱腦損失患者的納入標準規定如下：有昏迷史和顱腦外傷史；使用昏迷量表進行測定時評分應該低于8分；年齡處于14～55歲之間；昏迷時間在3～14 d內，且患者的體征正常。排除標準為：具有顱腦原法性疾病的患者；有嚴重的不可逆性腦干損害；出現嚴重的合并損傷；入院后1 d后死亡。

1.4 統計學方法

2 結果

70例創傷顱腦損傷病人鼻飼大黃湯劑后腦脊液中有大黃有效蒽醌類成分為大黃素甲醚。通過動物對該成分進行實驗中發現治療組大鼠腦皮質的SOD活力要明顯高于對照組。

大黃湯劑蒽醌類成分測定結果：大黃湯劑中的各個成分的相關系數都高于0.99，可見其標準曲線性較好；且大黃湯劑中含有蒽醌類成分測定結果的相對標準偏差在3%～5%以內。其中番瀉苷 B 濃度為（4.49±0.20），A 濃度為（12.81±0.70），大黃素質量濃度為（9.79±0.30），大黃素甲醚質量濃度為（5.41±0.32）。

實驗組測定結果：對照組大鼠腦皮質SOD活力為（19.92±1.07）U/mg Prot,治療組大鼠腦皮質 SOD 活力為（22.76±2.83）U/mg Prot,兩組大鼠的SOD活力有顯著差異，（t=5.640,P=0.012）。

3 討論

通過本次研究確定了創傷顱腦損傷病人鼻飼大黃湯劑后腦脊液中有大黃有效蒽醌類成分為大黃素甲醚，且大黃湯劑中的各個成分的相關系數都高于0.99。且在對兩組實驗鼠進行對比研究后得出給予大黃素甲醚灌胃的老鼠的大腦皮質的SOD活力要比給予生理鹽水灌胃組實驗組的大腦皮質的SOD活力要高，兩者相差在（5.1±1.75）U/mg Prot左右。研究結果證明了通過采用高效液相色譜方法對大黃湯劑蒽醌類成分進行測定能夠檢測出顱腦損傷患者的腦脊液中有大黃素甲醚成分，同時也證明了這一種成分具有的抗氧化作用[7]。目前，臨床上對大黃湯劑成分的測定研究并不多，而作為臨床上患者直接服用的一個藥劑，對其的測量是確保其質量符合臨床實際的一個關鍵[8]。王楊進行三組動物實驗對比結果得出SD大鼠腦皮質SOD活力在假手術組較模型組顯著增高,治療組較假手術組顯著增高，同時對超高效液相色譜方法在對大黃湯劑7種蔥酮類成分測定中也發現了創傷性顱腦損傷患者腦脊液中可吸收的有效生物成分。可見，采用超高效液相色譜測定方法測定具有有效性。

通過超高效液相色譜測定方法測定大黃湯劑蒽醌類成分后，在患者的腦脊液中測出了可吸收有效成分的大黃素甲醚，該成分在經過患者的胃腸道后會吸入適量的血，而后通過腦血屏障進入患者的靶器官中。大黃素作為生物活性成分在抗顱腦損傷中具有一定的作用，但是關于其如何發揮功效目前還不清楚。本次研究中從氧化應激方面進行了研究。氧自由基能夠誘導出提提的損傷而成為氧化應激，其是腦損傷后的其中一個有害路徑。而且腦外傷的嚴重程度同氧化應激的程度有很大的聯系，因為大腦中有很多容易受氧自由基攻擊的脂肪酸，因此在出現腦損傷后，腦細胞就會對應激神經變性很敏感。在沒有足夠的抗氧化劑介入之后，如果活性氧族原色過量就會導致氧化而引起脂質的破壞，進而誘發細胞血管結構出現氧化作用。SOD是機體中的活性物質，能夠在機體中起到消除有害物質的作用，而且還能夠在降低氧族元素導致的抗顱腦損傷[9]。因而，SOD能夠作為治療顱腦損傷的治療方法。本文章對大黃素甲醚能夠提高大鼠腦皮質中的SOD活力進行的驗證，該成分也為大黃可吸收有效成分作為大黃質量控制標準提供了依據。

本次研究得出以下結論：通過超高效液相色譜方法能夠測定大黃湯劑只能怪的7種成分，且簡單快速；大黃湯劑中的大黃色甲醚是顱腦損傷患者腦脊液中可吸收的成分；大黃素甲醚具有提高SOD活力的作用，能夠保護顱腦抗氧化。

總而言之，通過高效液相色譜測定大黃湯劑蒽醌類成分不僅精確而且簡單，值得推廣。大黃湯劑中的大黃素甲醚可能為大黃抗顱腦損傷的有效成分，且能夠提高顱腦損傷大鼠腦組織中的SOD活力，具有抗氧化顱腦的保護功效。

[1]范榮,黃熙,王楊,等.UPLC法測定腦外傷患者口服大黃吸收入血蒽醌類成分[J].世界科學技術(中醫藥現代化),2011（4）:676-680.

[2]王楊,黃熙,梁清華,等.超高效液相色譜法測定腦外傷患者口服大黃后尿液中蒽醌類成分[J].中草藥,2010（7）:1103-1106.

[3]堯愛珉,黃金秋,徐大星,等.RP-HPLC法測定梔子大黃湯中多種成分的含量及其在方劑配伍研究中的應用[J].中國藥科大學學報,2013（6）:531-535.

[4]閆云燕.蒽醌類活性成分群的中空纖維細胞捕獲及超聲乳化離子液體微萃取分析[D].山西醫科大學,2013（2）:12-14

[5]王志鵬，劉莉，梅其炳，等.唐古特大黃多糖對大鼠實驗性顱腦外傷的保護作用[J].中國中藥雜志，2010，28(10)∶974-977.

[6]黃熙.生物方劑分析中醫藥學研究的設想、背景與意義[J].中國中西醫結合雜志，2008，22(4)∶251-252.

[7]鄧杰,王明明,方國安，等.大黃對腦創傷患者血清細胞因子的早期影響[J].中國臨床藥學雜志,2010,15(1):50-51.

[8]蓋杰，司建偉，左俊杰.生大黃在重癥顱腦損傷中的應用[J].光明中醫，2011，22（3）∶30-31.

[9]Je-Hyun Lee,Jong Moon Kim,Chungsook Kim.Pharmacokinetic analysis of rhein in Rheum undulatum L[J].Journal of Ethnopharmacology,2009（84）∶5-9.