熒光共振能量轉移技術在激光共聚焦顯微鏡中的應用

肖忠新 張進祿*

目前，有許多蛋白與蛋白相互作用的研究方法，如親和層析、免疫共沉淀、凝膠阻滯法、熒光光譜法及酵母雙雜交等，而熒光共振能量轉移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)方法可在多種細胞類型中定量研究蛋白-蛋白相互作用，具有其他方法不可比擬的優點，在近年來廣受推崇[1]。20世紀30年代，法國物理學家Jean Perrin對FRET現象進行了描述，后由德國科學家Theodor[2]和F?rster[3]闡明，從1992年綠色熒光蛋白克隆成功后，FRET逐漸成為研究活細胞中分子之間相互作用的強有力的技術方法[4]。

1 FRET基本原理

FRET是指兩個熒光基團間能量通過偶極-偶極耦合作用以非輻射方式從供體傳遞給受體的現象，應用能量轉移來測量分子內和分子間的距離。FRET技術可在單個固定細胞或活細胞原位生理環境下檢測分子間的直接相互作用，如檢測配體-受體、蛋白質-蛋白質、蛋白質折疊以及蛋白質二聚化等。21世紀初，FRET現象已可利用3種方式進行研究，即光學強度成像測量、光譜測量和壽命測量[5]。

FRET的效率(E)與供體-受體間距離(r)的6次方成反比，即其中R0是E=50%時的供體-受體距離，稱為F?rster距離或臨界轉移距離。FRET的發生需滿足4個條件：供體-受體間距離≤10 nm；供體的發射光譜與受體的激發光譜有一定重疊；供體-受體偶極矩具有合適的相對取向；供體量子產率和受體光吸收系數足夠高[6]。

2 FRET的測定方法

用激光共聚焦顯微鏡檢測FRET具有獨特的優勢，利用其激光光源激發供體、多通道同時檢測雙重(或多重)熒光信號，并利用時間掃描程序檢測熒光信號在二維及三維空間的變化，且還可利用其軟件可得出定量測定曲線和數據[7]。利用激光共聚焦顯微鏡研究FRET有兩類常用方法：即敏化發射和受體光漂白測量方法。

2.1 敏化發射方法

敏化發射測量方法其原理是在激發供體的情況下檢測受體發射熒光的強度，其為FRET成像中簡單直觀的一種方法，適用于活細胞及熒光蛋白轉染的細胞。實驗前需構建熒光融合蛋白的重組載體，經酶切與測序鑒定正確后再進行共轉染細胞，在其轉染效率達到30%左右時進行測定[8]。在敏化發射方法中應注意兩種干擾因素：①Bleed through，激發供體的同時受體受到激發而發光，激發受體的同時供體受到激發；②Cross-talk，激發供體時在受體通路檢測到供體的發射光，激發受體時在供體通道檢測到受體的發射光。可通過計算各個通道內的串擾因子系數，將總FRET信號按照系數減去一定比例的串擾因子，得到FRET效率。目前，有許多推薦的方法具體指導串擾因子的扣除[8]。

在實驗中，除了測量待測FRET樣本實驗外，還需增加3個參考樣本對系統進行串擾校正，即供體熒光團的供體對照樣本、受體熒光團的受體對照樣本和已知FRET效率的校正樣本[9-10]。敏化發射方法也有其自身的限制，需要利用對照樣本對光學檢測系統以及熒光基團的光學性質進行事先校正，增加了實驗的工作量和難度[11]。敏化發射方法適于檢測固定細胞、活細胞和熒光蛋白轉染的細胞。在實驗中需注意，應去除光譜交叉和本底的影響，檢測過程較繁瑣，對樣品要求較高(需要有雙轉、單轉供體，單轉受體樣本)。

2.2 受體光漂白方法

受體漂白FRET(acceptor photobleaching FRET，apFRET)是一種檢測FRET的方法，其基本原理是，如果2個熒光分子存在能量轉移，對受體進行光漂白后其供體的熒光就會升高。通過檢測供體熒光的增強來計算FRET效率，FRET效率以供體熒光增強的百分數表示(公式1)：

式中I和I′分別為漂白前和漂白后的供體的熒光強度[12]。

在共聚焦顯微鏡上容易實現受體光漂白方法操作，測量FRET效率既不依賴于系統參數，也不依賴于供體與受體的量子產率和消光系數，只依賴于受體光漂白前后供體的熒光強度變化。然而，受體光漂白會對生物體造成的損傷，不利于在單細胞中進行多次測量，也不能在細胞中進行實時動態檢測[11]。

受體光漂白方法適于固定及免疫熒光標記的樣品，其優點是可完全克服“bleed through”，“Crosstalk”(光譜滲透干擾)，因此不需要進行復雜校正，測量比較簡便，容易獲得實驗結果；其缺點是因測量時需對受體熒光分子進行光漂白，如果樣品是活細胞，在光漂白的過程中，被檢測的分子會發生改變，所以只適合檢測固定樣品細胞內分子間相互作用。

3 FRET技術在實驗中的應用

3.1 FRET熒光對的選擇

在FRET體系中常用的熒光能量供體、受體對主要有CFP/YFP、BFP/GFP、GFP/RFP和CY3/CY5等[13-15]。目前，FRET技術需解決的問題是如何減少和排除非特異信號，提高對極低水平信號的探測[16]。而構建一個高效、特異的FRET探針并非易事，在研制熒光蛋白FRET探針過程中所面臨的主要問題則在于如何提高探針在活細胞中檢測的特異性和敏感性[17]。

選擇FRET熒光對應遵循的原則：①供體的熒光量子產率(QD)要大；②供體和受體的光譜重疊積分J(λ)應盡可能大，即供體發射光譜與受體激發光譜應盡可能多的重疊(＞30%)；③供體和受體之間光譜干擾(cross-talk)要盡量小；④有較高的信噪比(S/B)；⑤能量供體受體對要有適度的光漂白性質，從而有利于用不同的方法檢測FRET[18]。

由于在分子之間發生FRET的距離＜10 nm，FRET適合檢測較小的蛋白質的相互作用[19-21]。

3.2 FRET技術的局限性

FRET技術受客觀因素影響較多，如待測分子濃度、光漂白及激發光強度等，因此其重復性不夠好。用FRET檢測蛋白有相互作用，要求有較高的轉染效率設置對照等要求。目前，分析蛋白質間的相互作用需要結合兩種不同的方法相互取長補短才能得出一個科學的結論，通過結合FRET技術和免疫共沉淀技術能達到較理想的狀態[22]。

3.3 FRET技術的應用范圍

FRET的技術可用于檢測酶活性變化、細胞凋亡的研究以及膜蛋白的研究[23]。激光共聚焦顯微鏡已成熟應用于原位鑒定細胞或組織內生物大分子，觀察細胞及亞細胞形態結構等領域，許多有關蛋白分子的共定位、蛋白分子聚合體、轉錄機制和蛋白折疊等分子生物學問題均可通過FRET技術得到解決[24]。

4 FRET技術發展趨勢

在發光源、高級成像技術和理論分析模型等領域的創新推動了FRET技術的發展，以稀土發光材料作為供體的共振能量傳遞(luminescence resonance energy transfer，LRET)以及基于能量供體和能量受體之間非放射性的能量轉移的生物發光能量轉移(bioluminescence resonance energy transfer，BRET)的研究方法也相繼出現。今后隨著各領域方法技術的日益交匯融合，以及新儀器的層出涌現，生命科學的分析測試能力將不斷增強，為生命科學研究提供日益精尖的工具[16]。如FRET技術和熒光相關譜(fluorescence correlation spectroscopy，FCS)技術是兩種可在活細胞中檢測單分子行為的互補技術，FRET技術反映分子自身構像變化和分子間的空間距離變化，而FCS技術從分子熒光漲落中提取單分子的動態行為如濃度和擴散系數[25]。

綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)及其變種的發現以及顯微熒光技術的發展使得FRET技術在活細胞中的應用更加廣泛[11]。熒光蛋白、有機染料以及半導體量子點在單分子熒光技術上均有應用。由于其光穩定性遠強于熒光蛋白及有機熒光染料，半導體量子點作為一種新型的熒光探針正越來越廣泛地被采用[26]。未來隨著分子生物學的發展，測量儀器和技術方法的不斷更新和改進，探針的改進及數據分析的改進，FRET技術將有很大的發展空間，FRET技術必將對生命科學的發展起到重大的推動作用。

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