綠色熒光蛋白融合人核糖核酸酶抑制因子病毒感染NIH3T3細胞的研究*

李 坤 丁 寧

近些年來，隨著腫瘤的發病機制在基因水平上的逐步闡明，對腫瘤進行基因治療正成為腫瘤治療的又一重要策略。目前對腫瘤的基因治療，是指通過操作遺傳物質(無論是人類本身的或外源的)來干預腫瘤的發生、發展和進程，包括糾正人自身基因結構或功能上的錯亂，殺滅病變細胞或增強機體清除病變細胞的能力等，從而達到治療腫瘤的目的。其中深入了解靶基因的功能，尋找要害靶分子，對之實施打擊或補充是研究的重要內容。

核糖核酸酶抑制因子(ribonuclease inhibitor，RI)是一種相對分子質量為50×103的酸性糖蛋白，廣泛存在于細胞質可溶性部分。目前研究發現，大多數實體瘤能分泌血管生成素(angiogenin，Ang)刺激血管的形成來供應癌細胞生長和轉移[1-3]。而RI能與Ang通過1∶1化學計量比緊密結合并抑制其活性，從而可以抑制實體瘤血管的形成及腫瘤的生長、轉移[4-6]。另有研究發現，血管生成素具有促進腫瘤細胞增殖功能，因而RI可能成為腫瘤靶向治療的有效藥物[7]。為進一步研究RI的作用機制，本研究將已構建的過表達人RI基因的pLNCX-EGFP-C1-hRI載體，用上清感染法感染到NIH3T3細胞中，用熒光顯微觀察法和Western blot法檢測egfp-hRI基因在NIH3T3細胞的表達，為下一步基因治療研究奠定基礎[8]。

1 材料與方法

1.1 材料

反轉錄病毒pLNCX質粒購自美國CLONTECH公司。pLNCX-EGFP-C1-hRI質粒是由本室構建，NIH3T3包裝細胞購自中國科學院上海細胞庫(如圖1所示)。

圖1 本室構建的pLNCX-EGFP-C1-hRI質粒

1.2 試劑

質粒中量提取試劑盒購自Omega公司；DL2000 DNA Marker購自寶生物工程(大連)有限公司；Trizol、Lipofectamine 2000轉染試劑購自美國Invitrogen公司；G418購自美國Merk公司；RPMI 1640培養基、胰蛋白酶購自美國Gibco公司；胎牛血清購自杭州四季青血清生物制品有限公司；PVDF(聚偏二氟乙烯)膜購自美國Biosciences 公司；Polybrene、ECL化學發光顯色試劑盒購自美國Sigma公司；兔抗人核糖核酸酶抑制因子抗體由本實驗室制備；RIPA蛋白裂解液購自南京KEYGEN凱基生物。

1.3 細胞培養

包裝細胞PA317、小鼠NIH3T3細胞分別于含10%的胎牛血清的RPMI1640培養液中，37 ℃、5%的CO2的條件下培養。設置G418梯度質量濃度為0，100 mg/L，200 mg/L，300 mg/L，400 mg/L，500 mg/L，600 mg/L，700 mg/L，800 mg/L，900 mg/L，1000 mg/L，1100 mg/L，1200 mg/L，確定G418篩選濃度：PA317細胞為800 mg/L，NIH3T3細胞為400 mg/L。

1.4 PA317細胞的轉染及篩選

細胞按0.5～2.0×105鋪板于24孔板中，至細胞匯片至80%時，用Lipofectamine 2000轉染試劑按文獻[9]進行轉染，分為2組：pLNCX-EGFP-C1轉染組(對照組)、pLNCX-EGFP-C1-hRI轉染組(實驗組)。72 h后用800 mg/L G418篩選2～3周，獲得抗性單克隆后，繁殖、擴增、鑒定，選擇最高抗性克隆留種。其中，對照組陽性細胞命名為PA317/EGFP細胞，實驗組陽性細胞命名為PA317/EGFP-hRI細胞，分別收集細胞上清液，采用0.45 μm濾膜過濾，于-80 ℃保存備用。

1.5 NIH3T3細胞感染及熒光觀察

取對數生長期細胞按1.0×105鋪板于6孔板中，至細胞達到融合度約60%左右時，分別加入1 ml PA317/EGFP和PA317/EGFP-hRI細胞上清、終濃度為2 mg/L的Polybrene。每12 h感染1次，連續感染3次。實驗分為2組：PA317/EGFP感染組(對照組)、PA317/EGFP-hRI感染組(實驗組)，每組3復孔。感染48 h后，更換含400 mg/L G418的選擇培養液，連續篩選2周后，挑取G418的抗性單克隆，繁殖、收獲細胞，并用熒光顯微鏡觀察陽性重組質粒在NIH3T3細胞中的表達。同時設正常細胞NIH3T3作為陰性對照。

1.6 Western blot法檢測轉染后NIH3T3細胞中RI蛋白表達水平

收獲細胞，用含1 mMPMSF的RIPA蛋白裂解液提取蛋白，用BCA法蛋白定量。分別取60 μg蛋白電泳、轉膜，5%小牛血清封閉4 ℃過夜，一抗孵育2 h，二抗室溫孵育2 h，ECL化學發光試劑盒發光。曝光時間0.5～5 min。由Bio-Rad凝膠成像儀攝取凝膠圖像，用Image LAbTM軟件進行定量分析。

2 結果

2.1 熒光顯微鏡檢測陽性重組質粒在NIH3T3細胞中的表達

NIH3T3細胞本身綠色熒光表達微弱(如圖2a所示)；PA317/EGFP-hRI感染組(實驗組)，在細胞質中可觀察到重組質粒pLNCX-EGFP-C1-hRI表達的綠色熒光較強的分布(如圖2b所示)；PA317/EGFP感染組(對照組)，在全細胞中都可觀察到重組質粒pLNCX-EGFP-C1表達的綠色熒光分布(如圖2c所示)。

圖2 熒光顯微鏡檢測陽性重組質粒在NIH3T3細胞中的表達(×400)

2.2 Western blot法檢測hRI基因在蛋白質水平上的表達

結果表明，空白組(陰性對照)細胞可見RI基因和內參GAPDH基因條帶，RI基因相對表達強度分別為0.13±0.037；PA317/EGFP-hRI感染組(實驗組)和PA317/EGFP感染組(對照組)皆可見egfi-hRI基因和內參GAPDH基因條帶，egfi-hRI基因相對表達強度為0.81±0.28，與空白組和對照組相比，分別增加了83%和81%(如圖3所示)。

圖3 蛋白質印跡法檢測hRI的表達

3 討論

目前，腫瘤基因治療已經取得一些長足性進步，基因治療已經成為腫瘤治療研究的一種新手段[9-11]。而腫瘤基因治療載體分為病毒性載體和非病毒性載體。其中逆轉錄病毒載體是最常見的病毒載體，具有感染效率高、整合穩定等優點，但同時具有產生野生型病毒的危險等缺點[12-13]。本試驗采用病毒上清感染方法，雖然轉染效率低，但從安全性、可操作性、簡便性考慮，似乎更符合臨床基因治療的實際需要。

RI位于胞漿內，定位于染色體11p15.5區，分子質量約為50×103[14-15]。本研究用polybrene介導上清感染法將過表達hRI的表達載體pLNCX-EGFP-C1-hRI(綠色熒光蛋白融合hRI基因載體)轉染到NIH3T3細胞中。因為hRI為胞漿蛋白，在熒光顯微鏡下直接觀察到egfp-hRI基因在NIH3T3細胞質中大量表達，而轉染空載體pLNCX-EGFP-C1的綠色熒光在NIH3T3全細胞中均勻分布，這與EGFP無定位信號有關。熒光顯微鏡檢測的結果表明，pEGFP-C1-hRI表達質粒的表達成功。Western blot檢測egfp-hRI基因在蛋白質水平的表達增加。EGFP相對分子質量約為29×103，hRI蛋白分子質量約為50×103，EGFP融合蛋白分子質量約為79×103。Western blot法檢測結果證明egfg-hRI基因被表達，從而表明建立產生綠色熒光蛋白融合人核糖核酸酶抑制因子的NIH3T3包裝細胞系。

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