桔梗總皂苷對人肺腺癌細胞系A549移植裸鼠瘤生長和STAT2的影響

易亞喬 ，葛金文 ，伍參榮 ，喻 嶸 ，田雪飛 ，陳 懿 ，鄧璽瑋 ，彭國璇

（1.湖南中醫藥大學仲景學說教研室，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫藥大學中西醫結合基礎重點學科，湖南 長沙 410208；3.湖南中醫藥大學臨床醫學院，湖南 長沙 410208）

桔梗總皂苷對人肺腺癌細胞系A549移植裸鼠瘤生長和STAT2的影響

易亞喬1，葛金文2，伍參榮2，喻 嶸1，田雪飛2，陳 懿2，鄧璽瑋3，彭國璇3

（1.湖南中醫藥大學仲景學說教研室，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫藥大學中西醫結合基礎重點學科，湖南 長沙 410208；3.湖南中醫藥大學臨床醫學院，湖南 長沙 410208）

目的 探討桔梗總皂苷體內抑制人肺腺癌細胞系A549裸鼠移植瘤生長及其對腫瘤細胞信號傳導與轉錄激活因子2（signal transducer and activatorot transcription2，STAT2）的影響。方法 將荷人A549移植瘤BALB/c裸小鼠隨機分為模型組、環磷酰胺組、桔梗總皂苷組 1（5 mg/kg·d）、桔梗總皂苷組2（10 mg/kg·d）、桔梗總皂苷組 3（20 mg/kg·d）、桔梗總皂苷組4（25 mg/kg·d），分別治療觀察30 d，測量瘤體積與質量，并用HE染色觀察各組移植瘤組織的病理形態結構，用免疫組化法檢測瘤體細胞STAT2蛋白的表達。結果 模型組與桔梗總皂苷各組對人肺癌細胞系A549移植瘤抑制作用比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）；桔梗總皂苷對移植瘤體積與抑瘤率均顯示出較好作用，桔梗總皂苷組4移植瘤的體積明顯小于模型組、桔梗總皂苷其它各組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；桔梗總皂苷各組移植瘤體積大于環磷酰胺組，差異有統計學意義（P＜0.05）；桔梗總皂苷各組STAT2表達由強到弱隨濃度的增加而減弱，成劑量依賴關系，差異均具有統計學意義（P＜0.05）。結論 桔梗總皂苷對A549肺移植瘤組織生長有較好抑制作用，可能通過下調移植瘤組織STAT2蛋白表達來抑制瘤組織的生長。

桔梗總皂苷；人肺腺癌細胞系A549細胞；移植瘤；細胞信號傳導及轉錄激活因子2；裸鼠

目前國內外對細胞信號傳導及轉錄激活因子家族在肺癌方面的研究主要集中在細胞信號傳導及轉錄激活因子 3 （signal transducer and activatorot transcription3，STAT3），而細胞信號傳導及轉錄激活因子2（signal transducer and activatorot transcription2，STAT2）在肺癌組織中的表達，至今國內外相關研究極少。前期體外研究發現桔梗總皂苷對A549肺癌細胞的增殖有明顯的抑制作用[1]，為進一步探討其體內作用機制，本實驗采用免疫組化法檢測裸小鼠肺移植廇STAT2的表達，探討STAT2與肺癌發生及發展的關系，旨在研究桔梗總皂苷抑制人肺腺癌細胞系A549裸小鼠移植瘤生長的作用機制，為中醫藥有效防治肺癌提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 BALB/c 6～8周齡裸小鼠，SPF級，體質量（20±2）g，雄性，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物合格證號：SCXK（湘）2009-2004。

1.1.2 藥物 環磷酰胺口服片（南通精華制藥有限公司，規格：50 mg/片，批號：010052803）；由湖南省中醫研究院中藥超微中心提供47 g桔梗總皂苷粉，4℃保存，供試驗用。實驗時用細胞培養液稀釋成1 mg/mL。陽性對照藥：環磷酰胺（江蘇恒瑞醫藥股份有限公司產品，批號20110921203）。

1.1.3 試劑 STAT2 96T上海研鑫生物科技有限公司購入，美國GBD產品。

1.1.4 細胞 人肺腺癌細胞株A549購于中南大學湘雅醫學院現代實驗細胞庫。

1.1.5 儀器 酶標儀MK3(LABSYS TEMS公司)；HeraeusBB15細胞培養箱、Thermo702低溫冰箱、Thermo Scientific Holten超凈工作臺 (Thermo Scientific Forma 公司)；顯微鏡 Motic-BA400（Olympus公司，日本）；TGL-20M/TGL-20MC低溫離心機(長沙平凡儀器儀表公司)等。

1.2 方法

1.2.1 造模 實驗方法[2]以含有10%新生牛血清RPMI 1640培養基中，37℃ A549肺癌細胞、5%CO2的培養箱中培養，細胞貼壁，長滿細胞單層，用0.25%胰酶和 0.02%二胺四乙酸（EDTA）（1∶1）消化傳代。將處于對數生長期的A549肺癌細胞，常規胰酶消化、洗滌、計數后，以PBS調整細胞濃度為5×106/mL，用一次性無菌注射器將A549腫瘤細胞移植于裸鼠前肢腋下皮下，每只裸鼠注射0.2 mL，常規飼養、觀測裸鼠成瘤的時間、成瘤率。待裸鼠瘤體生長至直徑約5 mm時，開始藥物干預。

1.2.2 分組與給藥 采用隨機數字表隨機分為模型組，環磷酰胺組（10 mg/kg·d），桔梗總皂苷組 1、2、3、4（依次給予桔梗總皂苷 5、10、20、25 mg/kg·d）。每只裸鼠每天經口灌胃給藥1次，每次0.4 mL（給藥劑量按成人與大鼠間每公斤體質量占體表面積比值算得)；模型組給予相同體積生理鹽水。

1.3 指標評價

1.3.1 裸鼠移植瘤體積、質量測定 各裸鼠從用藥第 10、15、20、25、30 天分別測量腫瘤的大小，用游標卡尺測量腫瘤的最長徑及最寬徑。根據公式計算移植瘤體積V(mm3)=(最長徑×短徑2)/2。

1.3.2 裸鼠移植瘤抑制率計算 用藥30 d后處死動物，稱瘤質量，計算抑瘤率。 抑瘤率=（1-ET／EC）×100%（EC為對照組平均瘤質量，ET為治療組平均瘤質量）。

1.3.3 病理形態學觀察 待動物處死后，取各組裸鼠移植瘤送病理切片，HE染色觀察病理結果。

1.3.4 裸鼠移植瘤STAT2蛋白表達的檢測 取移植瘤組織標本石蠟包埋，切片，將STAT2抗體1∶100稀釋后，用免疫共沉淀試劑盒（Streptavidin-biotin immuno-perxidase complex kit），按照試劑盒操作說明檢測STAT2，陰性對照以封閉血清代替STAT2，其他操作步驟相同。蘇木素復染，光學顯微鏡下觀察，采用Motic Med 9.0數碼醫學圖像分析系統采集并記錄光密度值（每張切片隨機采集5個視野，測定每個視野下染色陽性區的平均光密度和面積），計算陽性區積分光密度，取其平均值用陽性區平均積分光密度值來表示STAT2免疫組化染色陽性的表達程度，積分光密度值越大，表示STAT2免疫組化染色陽性的表達程度越高。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 人肺癌A549細胞移植裸鼠成瘤率

A549細胞裸鼠移植術后2～3 d明顯可見質軟結節，隨后腫瘤不斷增大。平均成瘤時間為（5±2）d。60只裸鼠全部成瘤，成瘤率為100%。

2.1.1 不同時間各組裸鼠移植瘤體積的比較 對人肺癌細胞系A549移植癌的抑制作用，用藥15 d后，桔梗總皂苷各組與模型組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）；不同劑量的桔梗總皂苷對A459移植瘤的抑制作用差異有統計學意義（P＜0.05），藥物對裸鼠移植瘤的抑制作用亦隨劑量的增加，抑制作用逐漸增強。桔梗總皂苷組4裸鼠移植瘤的體積明顯小于模型組，用藥20 d后，與桔梗總皂苷1、2、3組比較差別均有統計學意義（P＜0.05）；桔梗總皂苷各組移植瘤體積大于環磷酰胺組，差異有統計學意義（P＜0.05）。 結果見表 1～2。

2.1.2 各組裸鼠移植瘤體質量與抑瘤率比較 桔梗總皂苷各組與模型組比較差異均有統計學意義（P＜0.05）；不同劑量的桔梗總皂苷對A549移植瘤體質量與抑制率差別有統計學意義（P＜0.05），其抑制作用亦隨劑量的增加逐漸增強，結果分析與上述對腫瘤體積影響基本一致。見表2。

2.2 桔梗總皂苷對裸鼠移植瘤組織病理形態的影響

模型組瘤細胞體積大且大小不均，呈彌漫性分布，細胞圓形多角形，排列呈巢狀、團塊或條索狀；核漿比例大，胞核深染，核分裂相多見；而環磷酰胺組、桔梗總皂苷各組瘤細胞體積較模型組、桔梗總皂苷各組減小，核漿比例明顯縮小，胞核染色較淺，核分裂相顯著減少，環磷酰胺組瘤體組織病理改善明顯優于桔梗總皂苷各組，結果見圖1。

2.3 桔梗總皂苷對裸鼠移植瘤STAT2表達的影響

模型組瘤細胞STAT2表達明顯高于環磷酰胺組、桔梗總皂苷各組，差異均具有統計學意義（P＜0.05）。環磷酰胺組STAT2表達明顯低于桔梗總皂苷組 1、2、3、4，差異均有統計學意義(P＜0.05）。 桔梗總皂苷各組STAT2表達由強到弱，成劑量依賴關系。結果見表3。

表1 不同時間各組裸鼠移植瘤體積的比較 （，mm3，n=10）

表1 不同時間各組裸鼠移植瘤體積的比較 （，mm3，n=10）

注：與模型組比較*P＜0.05；與環磷酰胺組比較△P＜0.05；與桔梗總皂苷組1比較＃P＜0.05；與桔梗總皂苷組2比較◇P＜0.05；與桔梗總皂苷組3比較▲P＜0.05；與桔梗總皂苷組4比較☆P＜0.05。表2同。

組 別模型組環磷酰胺組桔梗總皂苷組1桔梗總皂苷組2桔梗總皂苷組3桔梗總皂苷組4給藥量 mg/（kg·d）生理鹽水10 5 10 20 25 10 d 83.14±21.25 58.19±20.11*82.14±20.51△82.67±20.21△82.15±19.46△81.28±20.27△15 d 126.20±31.27 46.73±16.14*107.15±26.17*△◇▲☆98.27±30.21*△＃▲☆88.53±20.14*△◇79.72±22.01*△◇▲20 d 260.10±41.00 32.45±13.16*◇132.14±39.03*△◇▲☆101.10±41.00*△＃▲☆88.25±21.03*△◇☆74.14±30.26*△#◇▲25 d 367.11±55.05 20.14±4.16*◇227.11±38.05*△◇▲☆117.11±34.05*△＃▲☆85.11±30.11*△◇☆67.38±28.33*△#◇▲30 d 478.16±50.25 14.32±1.17*◇258.16±40.15*△◇▲☆128.16±32.30*△＃▲☆84.06±26.09*△◇☆58.10±20.30*△#◇▲

表2 各組裸鼠移植瘤給藥30 d后體質量和抑瘤率的比較（，n=10）

表2 各組裸鼠移植瘤給藥30 d后體質量和抑瘤率的比較（，n=10）

組 別模型組環磷酰胺組桔梗總皂苷組1桔梗總皂苷組2桔梗總皂苷組3桔梗總皂苷組4給藥量 mg/（kg·d）生理鹽水10 5 10 20 25體質量（g）5.01±1.21 1.21±0.32*＃◇▲☆3.68±1.18*△◇▲☆3.06±0.53*△＃▲☆2.64±0.51*△＃◇☆2.19±0.49*△＃◇▲抑瘤率（%）0 76.26±2.64*＃▲☆28.02±3.15*△◇▲☆39.21±4.65*△＃▲☆47.25±3.29*△＃◇☆57.42±3.85*△＃◇▲

圖1 各組裸鼠移植瘤形態病理顯微觀察圖（HE染色×200）

表3 各組裸鼠移植瘤STAT2光密度值測定結果比較（，n=10）

表3 各組裸鼠移植瘤STAT2光密度值測定結果比較（，n=10）

注：與模型組比較*P＜0.05；與環磷酰胺組比較△P＜0.05；與桔梗總皂苷組1比較＃P＜0.05；與桔梗總皂苷組2比較◇P＜0.05；與桔梗總皂苷組3比較▲P＜0.05。

組 別模型組環磷酰胺組桔梗總皂苷組1桔梗總皂苷組2桔梗總皂苷組3桔梗總皂苷組4給藥量 mg/（kg·d）生理鹽水10 5 10 20 25 STAT2（OD）66.78±12.146 6.12±2.32*＃◇▲50.68±10.13*△▲46.25±9.53*△▲30.17±8.59*△＃◇20.36±8.49*△＃◇▲

模型組瘤細胞中STAT2蛋白表達較多，光鏡可見棕黃色顆粒明顯，呈強陽性表達；而桔梗總皂苷各組棕黃色顆粒較少，呈弱陽性表達；環磷酸酰胺STAT2蛋白幾乎無表達。因為STAT2蛋白異常激活將導致細胞的異常增殖和凋亡障礙，促進腫瘤的發生、發展，相比模型組，桔梗總皂苷各組明顯下調STAT2蛋白的表達，且不同濃度的桔梗總皂苷對下調STAT2蛋白的作用有差異，結果見圖2。

圖2 各組裸鼠移植瘤腫塊STAT2表達的光鏡圖（免疫組化染色×400）

3 討論

肺癌為全世界發病率最高的惡性腫瘤之一[3]，中醫藥在內的多學科綜合治療及其機制研究已成為肺癌防治研究的熱點[4-5]。目前對于腫瘤發生機制的研究主要集中在腫瘤相關基因的克隆、細胞信號傳導通路以及細胞周期調控三大領域。其中，細胞信號傳導通路中的關鍵點—信號傳導與轉錄激活因子(signal transducers and activators of transcription，STATs)成為近年來研究的熱點。研究認為：STAT家族是具有高度同源性的轉錄因子，可介導多種細胞因子和生長因子的信號向細胞核內轉導，影響靶基因的轉錄，從而調節細胞功能，與腫瘤發生、發展和凋亡有密切關系。通過參與對調控細胞凋亡的細胞因子，蛋白激酶和抗凋亡基因表達的調節，對抗細胞凋亡，參與腫瘤的發生。STATs主要參與介導細胞因子和生長因子對細胞的信號轉導作用，調控靶基因的表達，進而影響著細胞的增殖、分化、衰老和凋亡，對腫瘤的發生和發展有重要作用[6]；STATs異常激活將導致細胞的異常增殖和凋亡障礙，促進腫瘤的發生、發展[7]；STAT2基因在腫瘤發展中呈現高表達[8]，即STAT2蛋白表達上調，腫瘤的發展越明顯。反之，表達減少，則可說明干預作用越好。

桔梗具有化痰止咳、排膿消癰的功效，臨床常用于肺系疾病（上呼吸道感染、肺膿腫、肺癌等）的治療[9]，前期通過體外實驗證實桔梗總皂苷對肺癌細胞A549的生長有抑制及誘導凋亡作用。該研究表明桔梗總皂苷對移植瘤體積與抑瘤率均顯示出較好的抑制作用，桔梗總皂苷對裸鼠機體移植瘤的抑制作用及抑瘤率亦隨劑量的增加抑制作用逐漸增強；對裸鼠移植瘤組織病理形態學的改變是瘤細胞體積較模型組減小，核漿比例明顯縮小，胞核染色較淺，核分裂相顯著減少，環磷酰胺組瘤體組織病理改善雖明顯優于桔梗總皂苷各組，但存在一定的藥物副作用，在抑瘤的同時會出現較多的不良反應。相對桔梗總皂苷，對腫瘤的發生發展有著很好的抑制作用，副作用不明顯、桔梗總皂苷在免疫調節的特異性免疫應答和非特異性免疫應答兩方面均有顯著的藥理活性，在這方面明顯優于環磷酰胺[10]。采用免疫組化法觀察移植瘤模型組瘤組織細胞STAT2蛋白表達明顯高于環磷酰胺組、桔梗總皂苷各組，提示STAT2確實參與腫瘤的發生發展；桔梗總皂苷能降低移植瘤組織STAT2蛋白表達，同時也證明桔梗總皂苷有對A549肺移植瘤有較好抑制作用，桔梗單味中藥可聯合其它中藥和中藥提取的有效成分共同且多靶點治療腫瘤（如黃芪、紫杉醇），為臨床腫瘤藥理研究提供進一步思路，值得進一步探討。

[1]易亞喬，伍參榮，葛金文，等.桔梗總皂苷對人肺腺癌A549細胞抑制作用研究[J]. 中華中醫藥雜志，2013，28（7）：30-33.

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[4]屠洪斌.益氣養陰方減輕肺癌放射治療毒副反應療效觀察[J].湖南中醫藥大學學報，2013，33(5)：86-89.

[5]王雅娟，俞森洋，黃建華，等.胰島素對人肺腺癌細胞A549化療增敏作用機制的研究[J].湖南中醫藥大學學報，2009，29(11)：3-6.

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[7]Burdelya L，KujawskiM，Niu G， eta1.Stat3 activity in melanoma cells affects migration of immune effector cells and nitric oxide-mediated antitumor effects[J].Journal of immunology，2005，174(7)：3 925-3 931.

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[9]徐國華，陸小松，戴小軍.桔梗在呼吸系統疾病中的應用近況[J].現代中西醫結合雜志，2001，10(20)：2 016-2 016.

[10]尹若熙，俞騰飛，李中燕，等.桔梗的藥理學研究進展[J].中國醫藥科學，2012，2(19)：36-37.

（本文編輯 徐愛良）

Effects of total platycodins on the growth of transplantation tumor of human lung adenocarcinoma A549 and STAT2 expression in nude mice

YI Yaqiao1,GE Jinwen2,WU Canrong2,YU Rong1,TIAN Xuefei2,CHEN Yi2,DENG Xiwei3,PENG Guoxuan3
(1.Teaching and research office of Zhongjing Theory,Hunan University of CM,Changsha,Hunan 410208,China;2.Key discipline of Integrated Chinese and Western medicine,Hunan University of CM,Changsha,Hunan 410208,China;3.College of Clinical Medicine,Hunan University of CM,Changsha,Hunan 410208,China)

Objective To investigate the inhibition effects of total platycodins on thetransplantation tumor growth of human lung adenocarcinoma cell line A549 and STAT2 expression in nude mice.Methods The BALB/c nude mice bearing human A549 lung cancer were randomly divided into modelgroup,cyclophosphamide group,platycodins group 1(5 mg/kg·d),platycodinsgroup 2(10 mg/kg·d),platycodinsgroup 3(20 mg/kg·d)and platycodins group 4(25 mg/kg·d).They were treated and observed for 30 days,and tumor volume and tumor mass were tested,morphology and the tumor tissues were observed by H-E staining,STAT2 expression was detected by immunohis to chemistry. Results There were significant differences between model group and each total platycodins group in the growth of the transplantation tumor of human lung adenocarcinoma cell line A549 in nude mice(P＜0.05).There were better inhibition effects on transplantation tumor sizes and tumor inhibition rates in all total platycodins groups.The transplantation tumor sizes in platycodins group 4 was significantly lower than those of model group and other platycodins groups(P＜0.05);transplantation tumor sizes in all total platycodins groups were greater than that of cyclophosphamide group(P＜0.05);STAT2 expression in platycodins groups were reduced gradually with the increasing of total platycodins(P＜0.05)and showed concentration-dependent effects.Conclusion Platycodins have good inhibition effects on A549 lung tumor,which maybe related with the down-regulation of STAT2 expression.

Total platycodins;human lung adenocarcinoma A549 cell;transplantation tumor;cell signal transducer and transcription activator 2;nude mice

R285.5；R734.2

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2014.03.003.007.05

2013－11－22

國家自然科學基金資助項目（30801496）；湖南省科技廳資助項目（2013TT2025）;湖南省教育廳科研基金重點項目（10A089）；湖南省教育廳青年基金資助項目（13B083）。

易亞喬，女，碩士，講師，主要從事腫瘤及心腦血管疾病中西結合防治研究。