自噬相關基因Beclin 1沉默對人肺癌A549細胞順鉑耐藥性的影響

任 爽 秦艷茹 張 巖 賈永旭 趙 松

(鄭州大學第一附屬醫院腫瘤科，河南 鄭州 450052)

順鉑(DDP)是肺癌化療常用的藥物之一，通過干擾DNA復制誘導細胞凋亡，還能促進細胞自噬性死亡，但癌細胞容易對其產生耐藥性。因此，如何增加癌細胞對其敏感性是困擾臨床亟需解決的問題。相關研究認為自噬是化療藥物作用機制之一，可能在耐藥性中發揮一定作用〔1〕。本實驗通過沉默自噬相關基因Beclin 1，探討其對人肺癌A549細胞DDP耐藥性的影響。

1 材料與方法

1.1材料 人肺癌A549細胞株由河南省高等學校臨床醫學重點學科開放實驗室凍存。Psilencer3.1質粒為鄭州大學基礎醫學院病理生理教研室保存。RPMI 1640培養液及胎牛血清購自美國Gibco公司。梭華-Sofast基因轉染試劑購于Calbiochem公司。T4 DNA連接酶、質粒提取試劑盒，購于南京凱基生物科技發展有限公司。Beclin 1、β-actin單克隆抗體購于Santa Cruz。四甲基偶氮唑鹽(MTT)購于Sigma公司。DDP購于山東齊魯制藥有限公司。

1.2Psilencer 3.1-siRNA-Beclin 1重組質粒的構建與鑒定 根據GenBank(NM_003766)Beclin 1基因mRNA的已知序列，選擇2個靶位點(285-304、676-695)，每條模板鏈的組成包括19個堿基正義鏈和與其互補的19個堿基的反義鏈，正反鏈之間有9個堿基(TTCAAGAGA)間隔，反義鏈之后有5個T作為轉錄終止信號，在模板鏈的兩端加入Bam HI及Hind Ⅲ酶切位點。兩條鏈在退火緩沖液〔100 mmol/L K-acetate，30 mmol/L Hepes-KOH，(pH7.4)，2 mmol/L Mg-acetate〕作用下退火(90℃ 3 min，37℃ 1 h)，形成雙鏈結構，在T4 DNA連接酶作用下連接于線性化的Psilencer 3.1質粒上，Psilencer 3.1-siRNA-Beclin 1重組質粒通過測序，RT-PCR及Western印跡方法鑒定。

1.3細胞培養 A549細胞常規培養于37℃、5%CO2、含10%胎牛血清的RPMI 1640培養液中。A549/DDP細胞的培養條件同前，但每隔兩代培養液中加入終濃度5 μmol/L的DDP以維持耐藥性。

1.4細胞篩選、轉染與分組 轉染前24 h，將生長狀態良好的A549/DDP細胞按1.5×105個/孔接種于24孔板，37℃、5%CO2恒溫培養。次日待細胞70%～80%融合時，將重組質粒轉染A549/DDP細胞(C組)，以空載體轉染細胞(B組)和未轉染的A549/DDP細胞(A組)為對照。

1.5RT-PCR方法檢測Beclin 1 mRNA的表達 收集A、B、C組細胞，總RNA提取按Invitrogen公司Trizol試劑盒說明書操作，以DNA/RNA測定儀測定RNA的純度和濃度。按逆轉錄合成試劑盒說明合成cDNA待用。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內參照，目的片段為452 bp，引物序列為:上游：5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，下游：5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。Beclin 1序列為：上游：5′-ATCCTGGACCGTGTCACCATCCAGG-3′，下游：5′-GTTGAGCTGAGTGTCCAGCTGG-3′，目的片段為363 bp。PCR條件：94℃ 1 min。55℃ 1.5 min。72℃ 0.5 min，共30個循環。結果用Quality One分析，以陽性條帶與GAPDH光密度比值作為陽性條帶的相對表達值。

1.6Western印跡檢測Beclin 1 蛋白的表達 收集各組細胞，用RIPA buffer 200 μl裂解細胞，考馬斯亮藍法進行蛋白定量，常規電泳、轉印和封閉后，分別加Beclinl抗體(1∶1 000) 4℃孵育過夜，堿性磷酸酶標記二抗(1∶3 000)，室溫孵育2 h，堿性磷酸酶染色5 min，膠片曝光顯影，結果用Quality One分析。用β-actin為內對照，以陽性條帶與內對照光密度比值作為陽性條帶的相對表達值。

1.7MTT法檢測細胞對DDP的耐藥性 將各組細胞按2×103個/孔接種于96孔板，24 h后加入終濃度為0、10、20、30、40、50、60、80、100、120 μmol/L的DDP，每濃度設3個復孔。孵育3 h后更換成完全培養基。72 h恢復期后每孔加入5 mg/ml MTT 20 μl，作用4 h后棄去上清液，酶標儀測量570 nm波長處的吸光度(A)值。計算細胞存活率，方法為各濃度組A值/未加藥組A值×100%，以Bliss法計算半數抑制濃度(IC50)。

1.8MTT法檢測細胞增殖情況 取對數生長期的各組細胞，胰酶消化后按2×103個/孔接種于96孔板，每組設6個復孔，共接種5板。每間隔1 d取出1板，MTT法測定A值。

1.9流式細胞儀檢測細胞凋亡情況 胰酶消化各組細胞，調整密度為1×106個/ml，冰磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞2次，結合緩沖液重懸細胞，分別加入annexin V-APC 5 μl和PI溶液10 μl，室溫避光孵育15 min，LSRII流式細胞儀(美國Becton-Dickinson公司)檢測細胞凋亡情況，Cell Quest軟件進行分析。

2 結 果

2.1轉染后A549/DDP細胞中Beclin 1基因的表達情況 以A組Beclin 1基因的表達水平為100%，C組細胞中Beclin 1 mRNA的表達水平下降(80±5)%，Beclin 1蛋白的表達水平下降(74±5)%，差異均有統計學意義(均P<0.05)；B組細胞中Beclin 1 mRNA和蛋白的表達水平是A組的(102±4)%和(96±7)%，差異均無統計學意義(均P>0.05)。

2.2轉染后A549/DDP細胞對DDP的耐藥性及增殖情況 與A、B組細胞相比，C組與DDP孵育后的細胞存活率明顯降低；C組細胞對DDP的IC50為(18±3)μmol/L，與A組細胞〔(40±12)μmol/L〕、B組細胞〔(42±9)μmol/L〕比較，差異有統計學意義(P<0.05)；B組細胞與A組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

2.3檢測后三組細胞凋亡率情況 流式細胞儀檢測C組細胞凋亡率為(9.5±1.1)%，與B組細胞〔(4.0±1.5)%〕、A組細胞〔(3.9±1.3)%〕比較，差異均有統計學意義(均P<0.05)。

3 討 論

Beclin 1是參與自噬的特異性基因，位于人類染色體17q21上，大約有150 ku。Beclin 1通過調節自噬水平參與細胞內大分子物質的循環及再利用、受損細胞器的清除，并維護細胞內環境穩態。DDP是用于肺癌的一線化療藥物，可抑制癌細胞的DNA復制過程，并損傷細胞膜結構，但其腫瘤耐藥性一直是臨床治療難以克服的障礙〔2〕。有研究〔3〕表明DDP等藥物可引起腫瘤細胞發生自噬，說明自噬可能與腫瘤耐藥性存在一定的關系。本研究結果提示Beclin 1基因沉默能一定程度地恢復A549/DDP細胞對DDP的敏感性，表明Beclin 1基因在肺癌DDP耐藥過程中發揮著重要作用。同時發現，細胞凋亡可能是Beclin 1基因參加肺癌DDP耐藥的機制之一。

本研究發現，靶向Beclin 1基因的質粒穩定轉染A549/DDP細胞后，細胞的增殖能力下降，可能與Beclin 1基因參與細胞周期的調控有關。提示Beclin 1基因在腫瘤細胞增殖中發揮著重要作用，通過RNA干擾下調Beclin 1基因表達，能抑制腫瘤細胞惡性增殖信號傳導，阻滯細胞周期進展，使細胞增殖能力下降。

綜上，以Beclin 1基因為靶點的RNA干擾技術可有效恢復A549/DDP細胞的化療敏感性，抑制細胞的增殖能力，針對Beclin 1的基因治療可能逆轉肺癌DDP耐藥。

4 參考文獻

1Rosenfeldt MT, Ryan KM.The role of autophagy in tumour development and cancer therapy〔J〕. Expert Rev Mol Med,2009;11:e36.

2潘麗紅, 趙 松, 黨麗峰, 等. 自噬在蛋白酶體抑制劑誘導的食管鱗癌細胞死亡中的作用〔J〕.中華實驗外科雜志, 2013;30(11): 2339-41.

3劉東雷, 王建軍, 楊 洋, 等.自噬在順鉑誘導的食管癌細胞死亡中的作用〔J〕.中華實驗外科雜志, 2010;27(9):1198-9.