降鈣素基因相關肽體外轉染對大鼠移植供肺白細胞介素-10、腫瘤壞死因子-α表達的影響

趙 松 張 巖 任 爽 李向楠 朱登彥 趙 佳 黃 琪 吳 彬 盧家奇 吳 愷

(鄭州大學第一附屬醫院胸外科 河南省高等學校臨床醫學重點學科開放實驗室 鄭州大學腫瘤分子外科研究所 鄭州市胸部腫瘤重點實驗室，河南 鄭州 450052)

通過構建增強型綠色熒光蛋白(EGFP)標記的降鈣素基因相關膚(CGRP)重組腺病毒載體(Ad5-CGRP-EGFP)，研究腺病毒介導CGRP轉基因對移植供肺細胞因子白細胞介素(IL)-10、腫瘤壞死因子(TNF)-α表達的影響。

1 材料與方法

1.1材料及試劑 河南省實驗動物中心提供的20只SPF級健康Wistar大鼠250～300 g。酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測定試劑盒和TNF-α、IL-10抗體購自Sigma公司。CGRP放射免疫分析試劑盒購自北京寶賽生物技術有限公司。Ad5-EGFP購自廣州生物基因科技發展有限公司。EGFP克隆基因能在異源組織中表達并可通過熒光顯微鏡觀察其產生的熒光，可通過構建Ad5-CGRP-EGFP，觀察CGRP基因表達。

1.2基因體外轉染方法 采用離體供肺靜脈逆行灌注轉染空病毒載體和Ad5-CGRP-EGFP。在4℃低鉀石旋糖苷(LPDG)液環境中，于獲取供肺15 min后開始均勻灌注已用4℃ LPDG液稀釋的空病毒載體和Ad5-CGRP-EGFP。灌注15 min，灌注壓力20 cmH2O。完成灌注后夾閉肺動靜脈，將供肺置于4℃ LPDG液保存，移植前以4℃ LPDG液沖洗肺血管床。

1.3實驗分組 假手術對照組5只：直接開胸后游離左肺動靜脈及主支氣管，摘除左肺；空白對照組5只：4℃ LPDG液左肺動脈順行灌注、左供肺離體肺靜脈逆行灌注；空載體對照組5只：4℃ LPDG液左肺動脈順行灌注、左供肺離體空病毒載體肺靜脈逆行灌注；基因轉染組5只：4℃ LPDG液左肺動脈順行灌注、左供肺離體重組腺病毒載體肺靜脈逆行灌注。空白對照、空載體對照、基因轉染三組供肺均在4℃ LPDG液中保存12 h取材檢測指標。

1.4檢測指標 (1)CGRP放射免疫測定：留取標本制成勻漿。4℃ 3 000 r/min離心15 min。取上清液按試劑盒說明書測定肺組織CGRP。(2)ELISA測定TNF-α、IL-10表達水平：標本制成勻漿，按試劑盒說明書方法測定。(3)基因轉染情況觀察：標本留取后行冰凍切片，厚約8 μm，用CK40倒置相差熒光顯微鏡在藍光下觀察標本綠色熒光變化。

2 結 果

2.1放射免疫測定CGRP 假手術對照、空白對照、空載體對照、基因轉染組分別為0、(1.51±1.15)pg/mg 、(1.66±1.52)pg/mg、(3.91±0.99)pg/mg。基因轉染組較高于空白對照組、空載體對照組(P<0.05)。

2.2四組TNF-α水平表達 空白對照組〔(8.01±1.22)pg/mg〕、空載體對照組〔(8.18±1.38)pg/mg〕與假手術對照組(0)比較，TNF-α表達量明顯升高(P<0.01)；基因轉染組〔(2.92±1.76)pg/mg〕與空白對照組、空載體對照組比較，TNF-α表達量下降 (P<0.05)。

2.3四組IL-10水平表達比較 空白對照組〔(5.02±1.25)pg/mg〕、空載體對照組〔(5.61±1.19)pg/mg〕與假手術對照組比較(0)，IL-10表達量明顯升高(P<0.01)；基因轉染組〔(10.01±0.95)pg/mg〕與空白對照組、空載體對照組比較，IL-10表達量明顯升高(P<0.05)。

2.4四組基因轉染情況 假手術對照組、空白對照組兩組無綠色熒光表現。空載體對照組和基因轉染組可見血管內膜、中膜、外膜呈現綠色熒光，部分肺組織亦可見綠色熒光，表明已成功轉染并表達綠色熒光蛋白。

3 討 論

CGRP由37個氨基酸組成，是應用DNA基因重組和分子生物技術研究發現的第一種生物活性多肽，在肺、心血管系統具有重要的生理作用。CGRP對于肺移植中出現的血管反應、炎性病變和免疫反應等具有抑制、對抗作用〔1〕。

臨床肺移植中，細胞因子在調節炎癥過程中起關鍵作用，在肺組織低溫缺血前期炎性細胞因子如TNF-α、干擾素(IFN-γ)等升高，而抗炎性細胞因子如IL-10、IL-12、IL-18水平下降。TNF-α是參與炎性損傷過程的重要細胞因子，可通過多種途徑引起肺損傷。IL-10是重要的抗炎細胞因子，一方面能抑制炎性因子的合成和釋放，另一方面直接抑制炎性細胞的激活、遷移和黏附，與其他抗炎介質有協同作用〔2〕。CGRP作為免疫活性物質可上調IL-10等抗炎性細胞因子，抑制TNF-α等炎性細胞因子，減弱抗原呈遞，具有抑制炎癥擴散的作用。

本研究表明Ad5-EGFP載體所承載的目的基因CGRP在延長保存12 h的移植供肺局部獲得明顯的表達。另外供體外CGRP轉基因可減輕供肺炎癥反應，可能與其下調前炎性細胞因子和上調抗炎性細胞因子介導的抗炎效應有關。

綜上所述，CGRP通過抑制多核或吞噬細胞分泌TNF-α等炎性細胞因子，促進IL-10等抗炎性細胞因子分泌，抑制炎癥反應〔1〕，從而發揮供體肺保護的作用。

4 參考文獻

1陳 椿，陳道中，陳春美，等.降鈣素基因相關肽體外轉染對大鼠同種異體肺移植物缺血再灌注損傷的影響〔J〕.中華實驗外科雜志，2008;25(11)：1469-71.

2李勁松，聶 君，陳 剛，等.大鼠肺缺血再灌注損傷不同時期基因表達譜的改變〔J〕.中華實驗外科雜志，2008;25(2)：200-2.