鐵皮石斛多糖對高糖狀態下視網膜Müller 細胞活力及凋亡的調控

李雅嘉 王 華 李強翔

(中南大學湘雅醫院眼科，湖南 長沙 410008)

糖尿病視網膜病變(DR)是糖尿病嚴重的微血管并發癥之一，分為非增殖性DR和增殖性DR〔1,2〕。Müller細胞是一種特化的神經膠質細胞，具有維持視網膜正常結構、營養視網膜等多種生理功能并參與多種病理過程，如參與增殖性玻璃體視網膜病變的發生〔3〕。目前多數研究證實，Müller細胞不僅起著支持和營養神經元的作用，還包括維持細胞外離子的穩定及參與谷氨酸鹽循環、突觸傳遞等作用，甚至對視覺信號的初級整合和處理也有重要的影響〔4〕。視網膜Müller細胞病變在DR進展中可能起著重要作用。因此，預防Müller細胞在糖尿病中的損傷應成為今后研究DR的重點。本文前期研究已發現，鐵皮石斛增強免疫抗衰老，全面修復血管、神經、代謝、免疫等系統病變，對糖尿病及血管并發癥有一定的防治效果〔5〕。本文通過觀察鐵皮石斛多糖(PDC)對高糖狀態下大鼠視網膜Müller細胞活力及凋亡的影響，探討PDC對糖尿病視網膜損傷是否有保護作用及其機制。

1 材料與方法

1.1實驗材料 PriCells大鼠視網膜müller細胞(武漢原生原代生物醫藥科技有限公司提供)；細胞凋亡試劑盒(碧云天生物技術研究所)；PDC，本研究組制備；低糖型DMEM培養液(美國Gibco公司)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；D-葡萄糖和胰蛋白酶粉末(美國Sigma公司)；CO2培養箱(武漢華海公司)；倒置生物顯微鏡(OLYMPUS 公司)；YXQ-LS-50SⅡ數顯立式蒸汽滅菌器(上海博迅實業有限公司醫療設備廠)；LDZX-40C型立式自控電熱壓力蒸汽滅菌器(北京六一儀器廠)；KH-600DB型數據超聲波清潔器(美國 JB/TEK 公司)；BD FACS Calibur流式細胞儀(美國BECTON DICKINSON公司)。

1.2高糖模型建立及實驗分組 Müller細胞經培養及傳代，待細胞達80%融合時棄掉含血清的培養液，換無血清的培養液培養24 h后，再換成含不同濃度葡萄糖的培養液，分別為5、10、15、20、25、30、35、40 mmol/L，通過12、24、36、48、72 h觀察后，確立Müller細胞高糖模型的最適糖濃度為25 mmol/L。實驗分組：(1)對照組(C組)；用10% 胎牛血清的RPMI1640培養基培養Müller細胞48 h；(2)高糖組(HG組)：用25 mmol/L葡萄糖處理Müller細胞48 h；(3～5)不同劑量PDC組(PDC組)：用100、200和400 μg/ml PDC處理Müller細胞48 h；(6～8)高糖+不同劑量PDC組(HG + PDC)：用25 mmol/L葡萄糖和100、200、400 μg/ml PDC共同處理Müller細胞48 h。

1.3四氮唑藍比色(MTT)法檢測細胞活力。

1.4流式細胞術檢測細胞凋亡率 單細胞懸液接種于6孔板，約5×105個/孔，每孔培養基2 ml，培養12～16 h細胞貼壁后更換高糖全培養基及分別加入PDC共培養48 h。(1)移除培養液，1倍磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗2次；(2)用不含乙二胺四乙酸(EDTA)胰酶消化細胞20～30 s，輕輕吹打后移至離心管；(3)800 r/min離心5 min，1倍PBS管內洗滌2遍；(4)分別加入200 μl的Binding Buffer吹打均勻，各組再依次加入5 μl Annexin V-FITC、5 μl propidiumIodide(陰性對照組除外)，混勻后移至專用流式細胞術EP管中；(5)室溫避光反應15 min；(6)在488 nm激發波長，525 nm發射波長的條件下，流式細胞儀檢測每管細胞的綠光及紅光熒光強度(MFI)，以此檢測各組細胞凋亡率。

2 結 果

2.1高糖和PDC對Müller 細胞活力的影響 與對照組(0.85±0.05)比較，高糖組Müller 細胞活力(0.41±0.02)顯著降低(P<0.05)；而相同濃度的甘露醇組(1.10±0.09)與對照組比較細胞活力沒有顯著性差異(P>0.05)；鐵皮石斛(100、200、400 μg/ml)組的細胞活力(0.89±0.06、1.01±0.07、0.95±0.05)與對照組比較沒有顯著性差異(均P>0.05)。與高糖組比較，高糖+鐵皮石斛(100、200和400 μg/ml)組細胞活力(0.59±0.06、0.79±0.04、0.96±011)均顯著增加，呈現濃度依賴性(均P<0.05)。

2.2高糖和PDC對Müller 細胞凋亡的影響 高糖組Müller 細胞凋亡率〔(44.94±7.01)%〕與對照組〔(6.09±0.59)%〕比較顯著增加(P<0.05)；而相同濃度的甘露醇組〔(7.20±0.69)%〕與對照組比較細胞凋亡率沒有顯著性差異(P>0.05)。鐵皮石斛(100、200、400 μg/ml)組的細胞凋亡率〔(7.01±0.58)、(7.79±0.97)、(7.57±0.92)%〕與對照組比較沒有顯著性差異(均P>0.05)。高糖+鐵皮石斛(100、200、400 μg/ml)組〔(32.46±5.01)、(19.21±4.12)、(9.35±0.91)%〕與高糖組比較，鐵皮石斛以濃度依賴的方式降低了高糖誘導的細胞凋亡(均P<0.05)。

3 討 論

DR是糖尿病引起的微血管病變，可造成視功能下降及視力喪失。DR是四大主要致盲疾病之一〔6〕。DR的發病機制至今尚未完全清楚，近年來許多國內外學者認為，Müller細胞和神經元一神經纖維相互關系的改變是早期DR視網膜功能異常的特點，Müller細胞在DR發生和發展中起重要的作用〔7〕。Müller細胞是哺乳動物視網膜主要神經膠質細胞，該細胞從內界膜延伸到外界膜，貫穿于整個視網膜，最易受病理因素的影響。在DR的發病過程中，一個最重要的因素就是高糖。Müller長時間暴露于高糖環境中，細胞的超微結構發生變化，細胞器受損導致細胞功能減退〔8〕。對DR的研究多采用動物模型進行體內實驗研究〔9〕，而在體外細胞水平研究不多，因此，利用體外培養視網膜Müller細胞是研究增殖性視網膜病變的最佳途徑之一。建立視網膜Müller細胞體外高糖模型，在體外模擬體內DM微環境，排除體內其他因素的干擾，在DM病程的發生發展過程中更加直接觀察細胞的變化，這些是體內動物實驗不能代替的。

凋亡是多細胞有機體為調控機體發育、維護內環境穩定，由基因控制的細胞主動性死亡過程。研究發現，細胞凋亡失常(過度或不足)參與許多疾病的發生與發展。DR的發病是多因素、多階段作用的結果，細胞凋亡在DR早期發揮重要終用。Müller細胞不僅參與視網膜的發育過程，而且還在維持細胞結構，營養神經元、清除毒性物質，保護神經元、胞膜表達離子通道與受體，發揮生物學效應、表達白血病抑制因子，保護光感受器、保持視網膜完整和正常的生理功能等方面起到了重要的作用〔10〕。正由于視網膜Müller細胞在維持視網膜結構和功能上的重要性，研究Müller細胞在高糖的影響下其活力及凋亡的變化，對進一步了解DR的發病機制具有重要的意義。有研究表明，在高糖環境下，石斛類多糖具有對多種細胞的保護和修復作用，不僅可以抵抗鈣超載，不僅可以抑制胰島細胞凋亡和壞死、保護胰島細胞，而且對高糖誘導的血管內皮細胞核轉錄因子(NF)-κB的過量表達有較好的抑制作用，對糖尿病血管病變有保護作用〔11，12〕。

本研究表明，PDC可能通過提高Müller細胞活性，減少Müller的凋亡，達到保護高糖狀態下視網膜損傷的作用。

4 參考文獻

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