Cox-2在結直腸癌中的表達

孟 韜 張大偉 劉林濤 吳 娜 楊曉波

(吉林省人民醫院，吉林 長春 130000)

結直腸癌(CRC)是我國常見的惡性腫瘤之一，近年來患病率逐年上升。由于術前早期診斷較為困難，術后判斷復發困難，對CRC的化療效果也不十分滿意。環氧化酶(COX)是一種雙功能酶，是花生四烯酸代謝為前列腺素類的關鍵限速酶。COX-2是COX中的一個亞型，在正常組織和情況下不表達，但可被廣泛的血管內外激活物質誘導產生，與CRC的發生發展及腫瘤的侵襲和轉移密切相關。

1 材料與方法

1.1臨床資料 選自吉林省人民醫院肛腸科2010年1月至2012年5月CRC手術標本50例，分別取淋巴轉移癌組織30例，未轉移癌組織20例，正常結腸黏膜組織10例，正常的結腸黏膜組織取自遠離CRC組織10 cm以上處，并在術后1 h內將標本歸類分組存于液氮。入選標準：(1)所有病例均行CRC根治術，標本由經驗豐富的病理醫師給出病理診斷并統計；(2)所有病例均具有完善的臨床資料并由專業人員統計；(3)術前未經放化療等系統治療；(4)沒有其他惡性并發癥；(5)術前未經非甾體抗炎藥(NSAIDs)治療。其中男33例，女17例。年齡35～84(平均60)歲。組織學類型均為腺癌。腫瘤直徑<5cm 22例，腫瘤直徑≥5cm 28例。TNM分期參照2009年UICC、AJCC CRC TNM分期(第7版)，其中T1和T2期10例，T3期30例，T4期10例。50例CRC標本中，術前癌胚抗原(CEA)表達陽性42例，陰性8例。分化程度：高分化(含高-中分化)腺癌16例，中分化腺癌25例，低分化(含中-低分化)腺癌9例。有淋巴轉移(淋巴結、神經、脈管侵犯)25例。

1.2主要試劑及儀器 RNA提取試劑Trizol美國進口；逆轉錄試劑盒購于大連Takara公司；熒光染料試劑盒購于大連Takara公司。LightCycler Real-time PCR擴增儀(Roche Diagnostics公司，瑞士)；高速臺式離心機：湘雅儀表廠；紫外分光光度儀(LKB.BIOCHROM.ULTROSPEC Ⅱ，日本)。

1.3實驗方法

1.3.1實驗分組 根據結直腸癌病例的病理結果，以是否有淋巴轉移為分組標準，分為淋巴轉移癌組織30例，未轉移癌組織20例，正常結腸黏膜組織10例。

1.3.2實驗步驟 Trizol法提取組織總RNA；逆轉錄(RT)；Real Time PCR 反應。

1.3.3實驗結果分析 反應結束后確認Real Time PCR的擴增曲線和熔解曲線，熔解曲線證實產物中不存在二聚體。使用LightCycler Software4.0(Roche)軟件進行數據分析，采用2-△△CT的方法分析各基因相對表達量。

2 結 果

Real time PCR擴增結果顯示，在癌旁結直腸正常黏膜組織(表達量設為1)、無淋巴結轉移的結直腸腺癌(表達量3.5±0.8)與有淋巴結轉移的結直腸腺癌(表達量7.2±0.9)三組之間COX-2表達水平有明顯差異(P<0.05)。COX-2基因表達從結直腸正常黏膜組織→無淋巴結轉移的結直腸腺癌組織→有淋巴結轉移的結直腸腺癌組織呈現逐漸增高的趨勢，各個階段兩兩比較差異有統計學意義(P<0.05)。

3 討 論

大量的流行病學研究證實，NSAIDs具有明顯的降低CRC發病率及病死率的作用。而經研究發現NSAIDs類藥物主要是通過抑制COX-2來發揮作用的。

COX又稱為前列腺素內氧化酶還原酶，兼有環氧化酶活性和過氧化氫酶活性，是生成前列腺素的關鍵限速酶。COX-2于1989年由Simmons等發現。在正常情況下，C0X-2除在腦、腎等器官表達很少量之外，其他器官基本上不表達，但在細胞外因子、癌基因或者致癌物的刺激下能迅速產生〔1〕。

目前監測COX-2表達水平有以下三種方法：(1)直接測定COX-2蛋白的表達，如免疫組化、Western-印跡；(2)直接測定COX-2的基因表達，如Reverse-Transcription Polymerase Chain Reactin(RT-PCR)、Northern blots；(3)通過檢測COX-2相關酶和COX-2產物后間接測定COX-2的表達，比如通過檢測PGE2量來測定COX-2的表達。此法所獲得數據比較準確，不足之處就是對標本的要求較高，費用也比單純免疫組化昂貴。

Sano等〔2〕研究指出COX-2蛋白在正常結腸黏膜組織、結腸腺瘤、CRC中的表達逐漸增高。徐菁等〔3〕研究指出COX-2與CRC的Dukes分期和是否發生淋巴轉移相關，而與其組織分化程度無關。本研究結果提示COX-2有促進CRC侵襲和轉移的潛能，即過表達COX-2的CRC具有更強的侵襲性，這為判斷CRC是否發生轉移和預后提供了一種重要的思路。

Eberhart等〔4〕發現，COX-2可上調腫瘤細胞CD44的表達，CD44可以促進細胞與細胞之間和細胞與細胞外基質之間的黏附，從而促進了CRC的轉移。Tamazawa等〔5〕發現COX-2可促進CRC細胞向基底膜和內皮細胞的黏附而增進腫瘤細胞的轉移。提示COX-2可直接通過改變腫瘤細胞表型來促進腫瘤轉移〔4〕。高表達的COX-2可產生大量的PGE2，具有免疫抑制作用，使腫瘤細胞逃避免疫監視，從而促進了CRC的發生發展。Masunaga等〔6〕發現了COX-2與毛細血管密度(MVD)顯著相關，MVD和腫瘤發生發展呈正相關，提示COX-2和CRC的發生發展關系密切。COX-2可促進促血管生長因子(VEGF)表達〔7〕，而VEGF可促進腫瘤新生血管形成，新生的毛細血管基底膜不連續，腫瘤細胞易于突破，最終促成了腫瘤細胞生長和轉移〔8〕。

淋巴轉移仍是大多數上皮來源的腫瘤轉移的主要途徑，但目前對惡性腫瘤如何發生淋巴轉移及影響因素仍不太明確。Dhar等〔9〕利用轉染了COX-2基因的CRC細胞株，發現能夠顯著提高VEGF-C的表達，而利用COX-2特異性抑制劑則能降低VEGF-C的表達。VEGF-C是人類發現的第一個淋巴管生長因子，是血管VEGF的成員之一。研究發現，VEGF-C與多種腫瘤的淋巴管浸潤和淋巴結轉移呈正相關。胡玉林等〔10〕發現在未發生淋巴管浸潤或無淋巴結轉移的腫瘤組中VEGF-C表達率均顯著低于發生了淋巴管浸潤及淋巴結轉移腫瘤組。VEGF-C通過與淋巴管上的特異性受體VEGFR-3結合后促進腫瘤淋巴管生成并改變淋巴通路通透性，從而促進了CRC的轉移〔11〕。COX-2的過表達可以促進VEGF-C在腫瘤細胞的表達，從而促進了CRC的淋巴管形成和淋巴結轉移。

COX-2全程參與從結腸正常黏膜-CRC-CRC轉移變化的整個過程，在這多步驟、多階段的變化過程中發揮了重要的作用。轉移性的CRC過表達COX-2，而高表達的COX-2則可促進CRC淋巴管的生成和淋巴轉移、血行轉移及遠處轉移，抑制機體的免疫反應，促進了腫瘤的轉移和復發。研究揭示了COX-2與CRC的相互關系及作用機制能夠幫助人類認識腫瘤的本質，研制針對COX-2的特異性藥物能夠降低COX-2的表達，抑制腫瘤生長和轉移，顯著的降低CRC的發生率及病死率〔12〕，這些都具有重要的理論和現實意義。

4 參考文獻

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7Liu XH，Kirschenbuam A，Yao S，etal.Up-regulation of vascular endothelial growth factor by cobalt chloride-simulated hypoxia is mediated by persistent induction of cyclooxygenase-2 in a metastatic human prostate cancer cellines〔J〕.Clin Exp Metastasis，2002；17(8)：687-94.

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9Dhar DK，Kubota H，Kotah T，etal.Tumor vascularity predicts recurrence in differentiatied thyroid carcinoma〔J〕.Am J Surg，1998；176(5)：442-27.

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11Tsujii M，Kawano S，Tsujii S，etal.Cyclooxgenase regulates angiogenesis induced by colon cancer cells〔J〕.Cell，1998；93(5):705-16.

12Thun MJ，Namboodiri MM，Calle EE，etal.Aspirin use and risk of fatal cancer〔J〕.Cancer Res，1993；53(6)：1322-7.