PhoPR雙組份系統在結核分枝桿菌致病機制中的研究進展

鄔 博，張萬江

結核病是由結核分枝桿菌(MycobacteriumTuberculosis, MTB)引起的傳染性疾病，其主要傳播途徑是通過氣溶膠方式經呼吸道感染機體引起肺結核。自MTB發現至現今，其仍舊是致死率較高的單一致病菌。并且隨著廣泛耐藥和多重耐藥結核桿菌菌株的出現，以及伴發有艾滋病患者的增加，致使結核病的防治工作更加嚴峻。而目前關于結核桿菌的致病機制還未完全闡明。PhoPR雙組份信號轉導系統(two-component signal transduction system, TCS)作為結核桿菌感應外界環境變化，并將這些變化信號傳遞到細胞內，引起細菌做出相應應答調控的一種系統，其在MTB適應宿主體內微環境變化的調控方面發揮了重要作用。隨著對PhoPR TCS認識不斷深入，PhoPR TCS在結核桿菌生理功能、代謝的調控方面中的重要性和關鍵性，特別是在細菌的致病機制的調控作用愈來愈受到關注。

1 PhoPR TCS概述

TCS作為重要的感應環境變化，并作出調控應答的系統，在細菌感應宿主微環境的變化以及適時地發揮調控應答等方面發揮了重要作用。1986年Ninfa和Magasnik在研究大腸埃希菌氮調節蛋白時，首次發現了TCS[1]， 隨后研究者在結核桿菌中發現了DosS/DosT-DosR、PhoP-PhoR、MprA-MprB、TcrX-TcrY、senX3-regX3、PrrA-PrrB、TrcR-TrcS、MtrA-MtrB等12個完整的TCS。

其中PhoPR TCS作為12個雙組份系統中最基本、最重要的感應外界環境變化，并作出相應應答的調控系統，其在結核桿菌適應環境變化調控方面有著重要作用。目前對PhoPR TCS的結構功能研究發現，PhoPR TCS是由兩個基本的元件構成，其中PhoR基因編碼的膜結合的組氨酸激酶感應蛋白(Histidine Kinase HK)，是一個保守的蛋白結構，主要負責感應接收外界環境變化的各種信號，并將這些信號傳遞給胞內的反應調節蛋白(Response Regulator,RR)，而RR是由PhoP基因編碼的，并由兩個區域組成：N末端接受區域包含了一個保守的磷酸化位點和幾何結合域的(α/β)5拓撲結構，C末端效應區域包含了一個有翼段的螺旋-轉角-螺旋的DNA結構域[2]。其中N末端的接受域主要負責接受來自PhoR蛋白的磷酸化信號；而C末端的效應域主要負責與所要調控的靶基因結合，調控基因的轉錄表達。Pathak[3]等人研究發現在這兩個功能域之間還存在一個有11個氨基酸殘基長度的連接子，它將PhoP蛋白的兩個功能域連接起來，并且調控著域間的相互作用。而且這個連接子可通過改變自身構象，將N端接受域的磷酸化信號傳遞給C末端的結合域，促使C末端的DNA結合域與相應的靶基因結合，發揮調控基因轉錄的作用。因此認為連接子在域間的相互調節中具有重要作用。并且PhoP蛋白域間相互效應可能是導致依賴性磷酸化高親和DNA的調節結構[4]。此外，有研究結果顯示DNA結合域能夠結合到DNA序列的二聚識別串聯重復結合位點上，這個結合位點位于靶基因的調節啟動子的-35區[5]。Cimino[6]等對PhoP蛋白的C末端DNA結合域所結合到的靶基因(msl3，pks2，lipF，fadD21基因)位點序列進行了研究，證實了PhoP蛋白結合在參與調控靶基因的上游共有序列上，這個共有序列由兩個直接重復子DR1，DR2和第3個相關的重復子DR3組成。在某些情況下，DR3對于PhoP蛋白結合到DR1和DR2具有重要作用。并且這個共有序列可被用于篩選全基因組中被PhoPR TCS直接調節的相關基因。而RR的主要功能是調控細胞內相應的靶基因進行轉錄翻譯相關蛋白，使這些蛋白發揮生物學效應，有利于MTB適應外界環境的改變，如低氧、鎂濃度改變以及酸性環境等。

2 PhoPR TCS與結核桿菌的毒力

結核桿菌的毒力因子可根據其毒力決定簇的功能、分子結構特點以及細胞內的定位分為以下幾個方面：(1)脂質和脂肪酸的代謝產物，包括膽固醇的分解代謝產物；(2)細胞膜蛋白，包括細胞壁蛋白、脂蛋白和分泌系統蛋白；(3)抑制巨噬細胞抗菌效應的蛋白，包括參與對活性氧/氮應激的反應蛋白以及阻止巨噬細胞吞噬體成熟和抑制細胞凋亡的蛋白；(4)蛋白激酶；(5)金屬蛋白酶類；(6)輸入、輸出的金屬轉運蛋白；(7)調控基因表達調控子，包括雙組分系統、sigma因子和其他轉錄調節子；(8)未知功能蛋白，包括PE和PE-PGRS蛋白家族；(9)其他毒力蛋白[7]。

結核桿菌的毒力因子在細菌的致病性上具有重要作用，而PhoPR雙組分系統在細菌毒力方面發揮著重要的調控作用[8]。RD1作為MTB毒力必需的基因區域[9]，它存在于致病結核桿菌復合群中。其中 PhoPR TCS參與調節RD1區域中的許多基因的轉錄表達，有一些基因是與介導毒力密切相關的基因。EspB基因位于RD1區的延伸區，是由1 383個堿基對構成的可以編碼466個氨基酸的基因。其編碼一種分泌型毒力蛋白，該蛋白最先在海分枝桿菌中發現，并命名為ESX-1分泌蛋白Mh3881c，通過深入研究發現該蛋白在結核桿菌國際標準強度株(H37Rv)中也存在著其同源基因Rv3881c，該基因參與了致病性結核桿菌ESX-1系統中EspB蛋白的分泌。EspB蛋白在分泌過程中的C末端被裂解為50 kDa和11 kDa兩個蛋白片段，進一步研究發現EspB蛋白的C末端與ESAT-6具有直接相互作用，并且對保持ESAT-6在細胞內的濃度水平是必需的[10]。研究還發現在分泌過程中EspB、ESAT-6和CFP-10的分泌是相互依賴的，對結核桿菌在巨噬細胞內的生長具有重要的作用，并且對巨噬細胞吞噬體的成熟發揮著抑制作用。在敲除EspB基因的突變菌株中，該菌株的毒力則幾乎喪失[11]，可見EspB在細菌毒力方面的作用似乎比ESAT-6和CFP-10更顯著。有研究表明，在敲除野生型結核桿菌菌株的PhoP基因后，細菌分泌表達EspB蛋白的量較親本野生型菌株顯著降低[12]。這個結果表明PhoPR TCS對EspB蛋白表達可能存在著調控作用，但是目前關于PhoPR TCS是否對EspB基因存在直接調控作用未見報道，同時在不同毒力結核桿菌菌株中EspB蛋白分泌表達量是否受PhoPR的調控仍需要進一步研究。此外有研究表明，在不同毒力結核桿菌菌株中，結核桿菌國際標準無毒株(H37Ra)、卡介苗菌株(BCG)以及PhoP缺失突變株在感染巨噬細胞后可導致細胞凋亡的時間都較H37Rv菌株縮短[13]。這表明PhoPR TCS在不同毒力菌株中調控結核桿菌的毒力可能存在差異，但是目前關于在不同毒力結核桿菌菌株中PhoPR TCS調控細菌的毒力基因的表達差異的變化未見明確的報道。

3 PhoPR TCS與結核桿菌的脂質

結核桿菌是一種兼性細胞內寄生菌，它不含有內毒素，也不會分泌外毒素和侵襲性酶類，其致病性主要與占細胞壁干重60%以上的脂質成分密切相關。這些脂質物質不但有助于結核桿菌抵御外界不利的生活環境，同時也在細菌逃避宿主免疫系統過程中發揮了重要作用。PhoPR TCS調控的多數靶基因參與合成以酰基海藻糖為基本物質的脂質。而在PhoP基因缺失突變菌株中因不能夠合成以酰基海藻糖為基本物質的脂質[14]，導致其毒力減弱。并進一步發現PhoPR TCS正性調控的基因如pks3, rv1184c, fadD21和pks2都參與了以酰基海藻糖為基本物質的脂質合成[15]。此外，PhoPR TCS調控的fas基因編碼一種脂肪酸合成酶，這個酶可以與FAS II系統聯合促使結核桿菌前體細胞合成分枝菌酸。而分枝菌酸是細菌胞壁的主要成分，其與海藻糖構成了海藻糖二霉菌酸酯(trehalose dimycolate,TDM)或稱為“索狀因子”(cord factor)。后者可以導致機體產生肉芽組織、影響細胞膜的融合并對線粒體有毒性作用[16]。

4 PhoPR TCS與宿主巨噬細胞的相互作用

結核桿菌通常形成氣溶膠方式經呼吸道感染宿主，進入肺臟的細菌可被巨噬細胞吞噬。其中大部分細菌可以被巨噬細胞殺死并清除到體外。但有少量的結核桿菌在巨噬細胞內存活下來，但是其生存將會遭遇細胞內不利環境的挑戰，包括活性氧/氮，酸性環境、低氧、營養缺乏等。結核桿菌為了逃避這些惡劣的生存環境，可以通過免疫逃避、休眠、以及降低自我增殖等多種應對方式避免宿主巨噬細胞對其殺傷，從而持久的寄生在細胞內。其中PhoPR TCS是結核桿菌感知微環境變化的主要系統，結核桿菌可通過這個系統對感知到的變化信息進行分析處理后，并調控相應靶基因的表達來使細菌適應微環境的改變。因此結核桿菌PhoPR TCS與宿主巨噬細胞的相互作用對結核桿菌在細胞內的長期生存有著重要的作用。

參考文獻：

[1]Ninfa AJ, Magasanik B. Covalent modification of the glnG product, NRI, by the glnL product, NRll, regulates the transcription of the glaALG operon inEscherichiacoli[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 1986, 83(16): 5909-5913.

[2]Menon S, Wang S. Structure of the response regulator PhoP fromMycobacteriumtuberculosisreveals a dimer through the receiver domain[J]. Biochemistry, 2011, 50(26): 5948-5957. DOI: 10.1021/bi2005575

[3]Pathak A, Goyal R, Sinha A, et al. Domain structure of virulence-associated response regulator PhoP ofMycobacteriumtuberculosis[J]. J Biol Chem, 2010, 285(45): 34309-34318. DOI: 10.1074/jbc.M110.135822

[4]Goyal R, Das AK, Singh R, et al. Phosphorylation of PhoP protein plays direct regulatory role in lipid biosynthesis ofMycobacteriumtuberculosis[J]. J Biol Chem, 2011, 286(52): 45197-45208. DOI: 10.1074/jbc.M111.307447

[5]Wang S, Engohang-Ndong J, Smith I. Structure of the DNA-binging domain of the response regulator PhoP fromMycobacteriumtuberculosis[J]. Biochemistry, 2007, 46(51): 14751-14761. DOI: 10.1021/bi700970a

[6]Cimino M, Thomas C, Namouchi A, et al. Identification of DNA binding motifs of theMycobacteriumtuberculosisPhoP/PhoR two-component signal transduction system[J]. PLoS One, 2012, 7 (8): e42876. DOI: 10.1371/journal.pone.0042876

[7]Forrellad MA, Klepp LL, Gioffre A, et al. Virulence factors of theMycobacteriumtuberculosiscomplex[J]. Virulence, 2013, 4 (1): 3-66. DOI: 10.4161/viru.22329

[8]Gonzalo-Asensio J, Mostowy S, Harders-Westerveen J, et al. PhoP: a missing piece in the intricate puzzle ofMycobacteriumtuberculosisvirulence[J]. PLoS One, 2008, 3(10): e3496. DOI: 10.1371/journal.pone.0003496

[9]Pym AS, Brodin P, Brosch R, et al. Loss of RD1 contributed to the attenuation of the live tuberculosis vaccinesMycobacteriumbovisBCG andMycobacteriummicroti[J]. Mol Microbiol, 2002, 46 (3): 709-717.

[10]Ohol YM, Goetz DH, Chan K, et al.MycobacteriumtuberculosisMycP1 protease plays a dual role in regulation of ESX-1 secretion and virulence[J]. Cell Host Microbe, 2010, 7(3): 210-220. DOI: 10.1016/j.chom.2010.02.006

[11]Gao LY, Guo S, McLaughlin B, et al. A mycobacterial virulence gene cluster extending RD1 is required for cytolysis, bacterial spreading and ESAT-6 secretion[J]. Mol Microbiol, 2004, 53(6): 1677-1693.

[12]Ryndak M, Wang S, Smith I. PhoP, a key player inMycobacteriumtuberculosisvirulence[J]. Trends Microbiol, 2008, 16(11): 528-534. DOI: 10.1016/j.tim.2008.08.006

[13]Gao Q, Kripke K, Arinc Z, et al. Comparative expression studies of a complex phenotype: cord formation inMycobacteriumtuberculosis[J]. Tuberculosis (Edinb), 2004, 84(3-4): 188-196.

[14]Perez E, Samper S, Bordas Y, et al. An essential role for phoP inMycobacteriumtuberculosisvirulence[J]. Mol Microbiol, 2001, 41(1): 179-187.

[15]Gonzalo Asensio J, Maia C, Ferrer NL, et al. The virulence-associated two-component PhoP-PhoR system controls the biosynthesis of polyketide-derived lipids inMycobacteriumtuberculosis[J]. J Biol Chem, 2006, 281(3): 1313-1316.

[16]Gilmore SA, Schelle MW, Holsclaw CM, et al. Sulfolipid-1 biosynthesis restrictsMycobacteriumtuberculosisgrowth in human macrophages[J]. ACS Chem Biol, 2012, 7(5): 863-870. DOI: 10.1021/cb200311s

[17]Ferrer NL, Gomez AB, Neyrolles O, et al. Interactions of attenuatedMycobacteriumtuberculosisphoPmutant with human macrophages[J]. PLoS One, 2010, 5(9): e12978. DOI: 10.1371/journal.pone.0012978