熒光偏振技術在布魯氏菌病檢測中的應用

訾占超，亢文華，馬 英，趙柏林

布魯氏菌病(簡稱為布病)是由布魯氏菌引起的人獸共患病，多發于家畜中的牛、羊、豬，引起高熱、流產等癥狀，陽性病畜暴露人群有高度的感染風險。世界動物衛生組織(OIE)曾將該病列為B類動物疫病，現在是必須報告的動物疫病，我國將該病列為二類動物疫病。中國政府制定的《國家中長期動物疫病防治規劃(2012-2020年)》(國辦發〔2012〕31號)中將該病確定為優先防治的國內動物疫病，并制定了控制凈化時間表。

近年來，布病感染病例呈回升態勢，特別是在內蒙古地區，成為嚴重影響公共衛生和社會經濟發展的問題，布病的防控形勢依然嚴峻。對于布病的防控，早期檢測是治療和預防的關鍵環節。目前用于檢測的技術有很多，細菌分離培養仍然是檢測的金標準，但是該方法在臨床上分離率較低，耗時長，且對分離環境和實驗室工作人員存在感染的威脅。血清學檢測多以光滑性脂多糖(lipopolysaccharides, LPS)為檢測抗原，包括試管凝集試驗(serum tube agglutinationtest, SAT)，玫瑰紅染色試驗(rose Bengal test, RBT)，改進玫瑰紅染色試驗(modified Rose Bengal test,m-RBT)，虎紅平板凝集試驗(rose-Bengal plate agglutination test，RBPT)，緩沖平板凝集試驗(rose-Bengalplateagglutination test, BPAT)，補體結合試驗(complement fixation test, CFT)，酶聯免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)，間接免疫熒光抗體試驗(indirect immuno- fluorescence assay, IFA)，膠體金免疫層析法(gold immumofiltraition assay, GICA)，全乳環狀實驗(milk ring test, MRT)，利凡諾 ( Rivanol) 試驗，卡片抗原試驗(Card Test, CT)，皮膚變態反應(Skin allergy)，微粒富集熒光免疫分析(particle concentration fluorescence immunoassay, PCFIA)，快速自動推定(rapid automated presumptive, RAP)等[1-2]。分子生物學檢測方法包括PCR，多重PCR，實時熒光PCR[3]，16SrRNA基因測序[4]，布魯斯階梯PCR[5]，以及近年來倍受關注的LAMP技術[6]。確診布病一般需通過兩種或兩種以上方法互相驗證。

1 熒光偏振技術的原理和應用

眾所周知，光具有波粒二象性，可以在任一平面均勻振動行進，當光通過某一平面時，會因平面作用而分成不均勻的能量光束，光的振動平面就發生了變化，在某一個方向振動強于其他平面，這種光就是偏振光。將光通過含有某種分子的溶液時，根據光的振動平面扭轉的方向和角度，可以對該分子進行推斷。熒光偏振分析(FPA)的基本原理是：某一分子在液體介質中的自旋速度與其分子質量有關，分子質量越小其自旋速度越快，偏振光束去極化越高，而分子質量越大自旋速度越慢，偏振光越弱。FPA以mP(milli-Polarization level)為單位測定分子的去極化程度。用異硫氰酸鹽標記(FITC)某種特異性抗原/抗體，若檢測樣本中存在該病抗體/抗原，抗原抗體結合后立即觀察結果，則可通過相關儀器檢測到產生的大量熒光復合物。在陰性樣本中，抗原/抗體呈現非復合狀態，由于該單體物質的分子量較小，自旋較快，因此，產生的去極化光較陽性復合物強[7]。

該方法不受溶液顏色、儀器靈敏度變化的影響，操作簡單，檢測時間短，適用于高通量樣本篩選，廣泛地應用于農藥和獸藥殘留分析、食品真菌毒素污染檢測、單核苷酸多態性篩選、實時熒光定量PCR-FP技術、核酸結構變化、蛋白激酶活性、體外細胞損傷、受體-配體和多態-配基等方面的研究[7-8]。FPA應用于致病微生物抗體檢測也有許多報道，如人乳頭瘤病毒、乙型肝炎病毒、異煙肼結合分支桿菌、肺炎支原體、肺炎衣原體、牛分支桿菌等。

2 熒光偏振技術檢測布魯氏菌抗體

FPA技術已經用于北美和歐洲的布病根除計劃，是OIE規定的“貿易適用”方法。O型脂多糖是牛魯氏菌、羊布魯氏菌、豬布魯氏菌等的共有抗原表位。常將牛布魯氏菌S1119.3株的O型脂多糖作為抗原，并標記異硫氰酸熒光素來檢測布魯氏菌抗體，作為診斷病畜感染布病的依據。

2.1牛布魯氏菌抗體的檢測 在檢測統計中，將敏感性和特異性的值相加定義為性能指數(Performance Index，PI)，在牛血清檢測中的性能指數，FPA和CELISA和IELSA水平相當，比CFT和BPAT要好。檢測免疫動物時，FPA和CELISA的特異性優于IELSA。

2.1.1牛血清中布魯氏菌抗體的檢測 自1996年起，就開始了FPA結合其它血清學方法對牛布魯氏菌的檢測。當時，對9 480份經BPAT、CFT、IELISA、CELISA檢測過的血清進行了FPA試驗。這些血清中，有561份來自曾經從組織或者牛奶中分離出布魯氏菌的牛，8669份來自流行病學和血清學均為陰性的牛，250份來自免疫后不同時期的牛。當cut-off值為90 mP時，FPA的敏感性和特異性分別是99.02%、99.96%，均高于其他方法[9]。

對1947份布魯氏菌培養陰性牛樣品和146份陽性牛樣品進行檢測，FPA和CELISA進行的雙ROC方法分析，當cut-off值為15.5 mP時，FPA的敏感性和特異性為99.1%和96.6%[10]。運用FPA、CFT、RIV、RBT方法對墨西哥的568份牛血清進行檢測，RBT的敏感性和特異性為98.3%、68.8%，RIV的敏感性和特異性為99.3%、55.4%，而FPA在cut-off值為89.9 mP時，敏感性和特異性為99.0%、96.9%，FPA的PI值最高。CFT和FPA的卡方值為0.96，說明FPA操作方便，但可以獲得與CFT相同的結果，可以做為CFT的替代方法[11]。

為了評價FPA的田間應用價值，分別對新鮮的全血、貯存全血和血清進行了檢測。423份新鮮全血檢測結果顯示，cut-off值為105 mP時，其敏感性和特異性分別為95.3%、97.3%。對1114份貯存全血進行檢測，cut-off值為95 mP時，其敏感性和特異性均為100%。對1 114份血清進行檢測，cut-off值為90 mP時，其敏感性和特異性均為100%。對691份全血及與之對應的血清進行了FPA檢測，當cut-off為95 mP時，敏感性和特異性分別為98.6%、98.9%，cut-off為90 mP時，敏感性和特異性分別為98.6%、100%[12]。

2.1.2奶樣品中布魯氏菌抗體的檢測 乳環試驗是檢測牛奶中含有布魯氏菌抗體的一種經典的方法，但是不適于保存超過48 h后乳品樣品。選取1 276份經MRT檢測為陽性的牛奶樣品和2 974份陰性牛奶樣品，分別用IELISA、CELISA、FPA方法進行檢測。當FPA的cut-off值定為90 mP時，其敏感性為82.2%，特異性為99.4%。雖然IELISA的敏感性和特異性均接近100%，但是不能區分疫苗抗體和感染抗體。FPA敏感性相對較低，可能是MRT和IELISA方法檢測到疫苗抗體而產生假陽性[13]。對219份陰性奶缸奶樣和39份陽性奶缸奶樣的檢測中發現，FPA的敏感性和特異性可以達到100%和95.9%[14]。

2.1.3野牛布魯氏菌抗體的檢測 對檢測野牛血清中的布魯氏菌進行了預試驗，這些血清來自無布病臨床癥狀和流行病學證據的地區，實驗采用2807份陰性血清，38份陽性牛血清樣品。5種血清學方法比較發現，IELISA的敏感性雖然很高，但是不能區分疫苗抗體和野毒感染抗體，也不能區分布魯氏菌和產生交叉抗體的其他細菌。FPA和CELISA相比，兩者的敏感性相同，但是FPA的特異性較CELISA稍高，可以達到每1000個樣品減少10個誤診樣品[15]。

2010年的一項研究對美國黃石國家公園(YNP)的190份樣品和來自一個私人擁有的189頭野牛樣品進行了檢測，該研究采用了FPA、SAT、BPAT、CFT、CARD、CELISA方法。研究結果顯示，FPA與其他方法相比，特異性成對協方差(pairwise covariance)為0.073～0.144(平均為0.106)，敏感性成對協方差為0或可忽略。貝葉斯分析方法表明FPA的敏感性為97.7%～98.8%，特異性為97.5%～98.1%。決策樹分析(decision-tree analysis)認為，SAT平均成本最低為620美元，其次是FPA，647美元，其他血清學方法成本最低為703美元，最高為943美元。考慮到野外檢測及技術發展，FPA比其他方法更有降低成本的潛力。FPA不能區分急性感染和隱性帶菌個體的缺點還有待改進[16]。

2.1.4水牛布魯氏菌抗體的檢測 對890份意大利水牛血清樣品(其中364份經CFT檢測為陽性樣品，526份為陰性樣品)進行布魯氏菌血清學檢測，結果發現FPA在cut-off值為117 mP時，敏感性為92.6%，特異性為91.2%；而RBT檢測水牛血清中布魯氏菌的敏感性為84.5%，特異性為93.1%。FPA比RBT的敏感性顯著較高，特異性沒有明顯差別。在結果分析中應用了ROC分析來評價FPA，以此來確定cut-off值，并實現最高的性能指數，提供更確切的結果。FPA技術在意大利實施的水牛檢測-屠宰計劃中起到重要的作用[17]。

2.2羊布魯氏菌抗體的檢測 經墨西哥官方標準(CT和CFT，CFT方法對CT檢測為陽性樣品進行驗證試驗，NOM)檢測的1488份陽性和1 094份陰性山羊血清運用FPA方法復檢，并進行ROC曲線分析，發現當cut-off值為89 mP時，FPA的特異性為82.1%，敏感性為82.2%。運用FPA和CT方法對1094份CFT檢測為陰性的樣品檢測，FPA陰性檢出率為82.2%，CT陰性檢出率為65.1%為。對來自無布病山羊群的712份陰性樣品進行檢測，發現有30份樣品為陽性，總體特異性為95.8%。此研究認為FPA方法比CT方法更敏感，可以檢出CT檢測中漏檢的假陰性樣品。FPA的cut-off值可以根據不同的流行病狀況進行調整，可以用來進行免疫羊群的篩選，降低羊只被誤殺的幾率[18]。運用FPA對166份陽性綿羊血清樣品和851份陰性綿羊血清樣品進行檢測。陽性樣品細菌培養為馬耳他布魯氏菌陽性，陰性樣品來自無馬耳他布魯氏菌史的健康綿羊群。結果顯示cut-off值為87 mP時，FPA的敏感性和特異性分別為97.6%和98.9%。細菌分離為陽性的血清樣品產生的免疫反應較強，抗體滴度高，易檢測，用這種血清做陽性參考血清，會同時提高血清學方法的敏感性和特異性。為了評價的客觀性，重新選擇了587份樣品對FPA進行評價。這些樣品來自羊布魯氏菌感染綿羊群，并且應用RBT、m-RBT、CFT、IELISA、CELISA中的至少兩種方法同時檢測為陽性。發現cut-off值為87 mP時，FPA敏感性為95.9%，仍較其他方法高[19]。

除了對血清的檢測外，還應用FPA等血清學方法對免疫Rev-1疫苗的血清抗體進行了研究。多數綿羊免疫后21 d，FPA、RBT、m-RBT、CFT及CELSIA方法均可以檢測到抗體，而IELSIA直到免疫后42 d才可以檢測到抗體。FPA對免疫63 d的羊羔的抗體檢測的方法特異性最高，與其他方法相比，差異顯著。利用FPA，CELISA和CFT對免疫后330 d的成年羊進行抗體檢測，3種方法差異不顯著。FPA和CELISA對青年羊和成年羊免疫抗體檢測顯示早期抗體檢測特異性較其他方法高。在執行檢測屠宰政策的地區，所有血清學方法對免疫后的120天羊群檢測準確率都較高，而FPA配合CELISA方法可以顯著提高根除計劃的效率[20]。

LPS抗原容易和羊布魯氏菌Rev.1株疫苗及腸炎耶爾森氏菌OI∶9型產生交叉反應。按照OIE《陸生動物診斷試驗和疫苗手冊(哺乳動物、禽鳥與蜜蜂)2004版》中傳染病診斷方法驗證規則，將FPA常用的LPS O型抗原(OPS)替換為馬耳他布魯氏菌Rev.1株疫苗的天然半抗原(native hapten，NH)。兩種抗原標記的FPA方法對48份陽性樣品和96份陰性樣品進行檢測發現，當cut-off值為86 mP時，NH抗原FPA的敏感性和特異性性分別為95.7%、99%，OPS標記的FPA方法敏感性特異性分別為91.3%、99%[21]。對NOM檢測的1009份陽性樣品和2 039份陰性樣品進行檢測，NHFPA的cut-off值為107.5 mP，敏感性和特異性分別是79.5%、84.3%；OPSFPA的cut-off值為95.3 mP時，敏感性和特異性分別是75.9%、81%。ROC分析認為NHFPA比OPSFPA具有4%的優越性。并且NHFPA僅使用10 μL血清，比OPSFPA使用的25 μL或40 μL少。在隨后的研究中發現，如果僅僅使用NOM的RBT3方法假陽性率為67.3%，使用CFT(>1∶4)方法對RBT3篩查陽性進行確診試驗，假陽性率為34.5%，而使用NHFPA對RBT3篩查陽性進行確診試驗，假陽性率可以降到5.5%。NHFPA配合RBT3方法對疫苗使用率較高的地區和流行率嚴重地區更有效[22]。

2.3豬布魯氏菌抗體的檢測 FPA和其他幾種血清學實驗方法相比，只需要加入抗原，不需要洗滌步驟，5 min之內即可完成試驗，并且可以在野外操作，成本較低，容易實現大通量檢測，其結果可以和間接ELISA相媲美。利用幾種血清學方法對14037份加拿大無布病豬血清和401份染病豬血清進行檢測，發現FPA方法進行豬布魯氏菌病檢測其敏感性和特異性均比較高。可以采取FPA方法檢測豬群中布病達到凈化目標[23]。需要注意的是，如果使用凍干血清進行檢測的時候，溶解血清后，可能產生較大的復合物，導致陰性血清的偏振值升高，從而降低了敏感性[24]。

2.4鹿布魯氏菌抗體的檢測 對1991、1994、1998年保存的北美馴鹿、麋鹿、馬鹿、黇鹿、北歐馴鹿樣品檢測中發現FPA的敏感性和特異性與cELISA相當。FPA可以將疫苗抗體及交叉抗體，如腸結腸炎耶爾森氏菌O:9等細菌產生的抗體，與布魯氏菌產生的抗體相區分。與FPA方法相比，CFT實驗的程序繁瑣，特異性受抗補體處理影響較大，另外抗補體處理血漿容易凝血，所以此方法不適于鹿布病的檢測；BPAT在樣品處理過程中容易使血漿形成纖維素，影響了結果的判定；IELISA的陽性結果和BPAT結果一致，但特異性不及cELISA和FPA，且不能區分疫苗抗體和交叉反應抗體。在對免疫了流產布魯氏菌19株的麋鹿樣品進行檢測發現，從特異性來看，FPA為84%，cELISA為51%，BPAT為14%，CFT為31%。FPA比較適合進行鹿群布病的檢測[25]。

2.5駱駝布魯氏菌抗體的檢測 應用實時熒光PCR、RBT、SAT、CFT、cELISA及FPA技術對來自蘇丹的895份駱駝血清進行布魯氏菌的檢測，所有的血清學方法都檢測到595份陽性樣品和170陰性樣品，另有72份陽性樣品僅能通過FPA檢測到。試驗結果顯示實時熒光PCR、FPA、CFT、RBT、SAT、cELISA的陽性血清檢出率分別是84.8%、79.3%、71.4%、70.7%、70.6%、68.38%，敏感性分別達到91.7%、83.9%、77.2%、76.5%、76.3%、74.4%。對檢測結果進行的卡方分析顯示，實時熒光PCR雖然有很高的敏感性但是其特異性較血清學方法差。考慮到速度、結果的分析目的、價格等因素，FPA可以代替其他駱駝布病的檢測方法，但FPA進行駱駝布病檢測的重復性有待進一步研究[26]。

2.6人布魯氏菌的檢測 人布病的診斷是依靠臨床癥狀和實驗室細菌學和血清學檢測方法。同時應用FPA、競爭ELISA及其他血清學方法對587份樣品進行檢測，FPA的敏感性達到96.1%，特異性達到97.9%。84例可疑病例中，FPA檢出80例陽性病例；87例感染病例中，競爭ELISA發現了18份陽性樣品，而FPA方法檢測到19份陽性樣品。FPA技術可以進行人感染布病的快速檢測，并且可以有效進行治療過程的監控，尤其是治療后的布病復發的監控意義重大[27]。

3 展 望

熒光偏折技術主要用于小于160 kD抗原的測定，其檢出限度在0.1～10 ng，并且與檢測抗原相匹配的單抗或多抗的獲得也影響了該方法的廣泛應用[28]。但是，熒光偏振技術對于研究分子間相互作用是極為有用的，因為它是一個對于分子大小、結合和解離都很敏感的方法。熒光偏振技術和ELISA技術生物學反應原理相似，但操作簡便，用時較短，成本低，有效區別感染抗體、免疫抗體、交叉抗體，可以進行田間使用等優勢遠超ELISA技術。大量的研究結果表明，在布病的抗體檢測方法中，FPA的特異性和敏感性比其他血清學方法高。隨著偏振熒光儀便捷性、檢測費用、配套試劑的優化改進，一些人和動物疫病診斷中建立的ELISA方法，有望在一定程度上被FPA所取代。

參考文獻：

[1]World Organisation for Animal Health. Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals[M]. 5thed, translated by Ministry of agriculture Veterinary Bureau/China Animal Health and Epidemiology Center, 2004: 705-708. (in Chinese)

世界動物衛生組織.陸生動物診斷試驗和疫苗手冊(哺乳動物、禽鳥與蜜蜂)[M]. 5 版.農業部獸醫局/中國動物衛生與流行病學中心譯，2004：705-708.

[2]Alton GG, Jones LM, Angus RD, et al. Techniques for the brucellosis laboratory[M]. Paris: Institute National de la Recherche Agronomique, 1988.

[3]Liu ZG, Luo CW, Zhang L, et al. Multiplex fluorescence quantitative PCR detection onBrucelllaspp.,Brucellaabortus, andBrucellamelitensis[J]. Chin J Zoonoses, 2012, 28(9): 869-874. (in Chinese).

劉志國，羅成旺，張利，等. 多重熒光定量PCR方法鑒定布魯氏菌屬及牛羊種布魯氏菌研究[J].中國人獸共患病學報，2012，28(9)：869-874. DOI:10.3969/cjz.j.issn.1002-2694. 2012.09.002

[4]Dash N, Panigrahi D, Al-Zarouni M, et al. 16S rRNA gene sequence analysis of aBrucellamelitensisinfection misidentified asBergeyellazoohelcum[J]. J Infect Dev Ctries, 2012, 6(3): 283-286. DOI: 10.3855/jidc.2252

[5]Lopez-Goni I, Garcia-Yoldi D, Marin CM, et al. New Bruce-ladder multiplex PCR assay for the biovar typing ofBrucellasuisand the discrimination ofBrucellasuisandBrucellacanis[J]. Vet Microbiol, 2011, 154(1/2): 152-155. DOI: 10.1016/j.vetmic.2011.06.035

[6] Song LY, Li JT, Hou SP, et al. Establishment of loop-mediated isothermal amplification (LAMP) for rapid detection ofBrucellaspp. and application to milk and blood samples[J]. J Microbiological, 2012, 90(3): 292-297. DOI: 10.1016/j.mimet.2012.05.024

[7]Zhao C, Zhang L, Ni Y. Development of fluorescence polarization in life sciences[J]. Progr Mod Biomed, 2010, 10(16): 3154-3156. (in Chinese)

趙晨, 張亮, 倪原. 熒光偏振技術在生命科學中的研究進展[J].現代生物醫學進展，2010，10(16)：3154-3156.

[8]Wang ZH, Zhang SX, Shen JZ, et al. Development of fluorescence polarization immunoassay for determination of pesticides and veterinary drugs[J]. Spectrosc Spect Anal, 2007, 27(11): 2299-2306. (in Chinese)

王戰輝，張素霞，沈建忠，等. 熒光偏振免疫分析在農藥和獸藥殘留檢測中的研究進展[J].光譜學與光譜分析，2007，27(11)：2299-2306.

[9]Nielsen K, Gall D, Jolley M, et al. A homogeneous fluorescence polarization assay for detection of antibody toBrucellaabortus[J]. J Immunological Methods, 1996, 195(1): 161-168. DOI: 10.1016/0022-1759(96)00116-0

[10]McGiven JA, Tucker JD, Perrett LL, et al. Validation of FPA and cELISA for the detection of antibodies toBrucellaabortusin cattle sera and comparison to SAT, CFT, and iELISA[J]. J Immunological Methods, 2003, 278(1): 171-178. DOI: 10.1016/S0022-1759(03)00201-1

[11]Dajer A, Luna-Martinez E, Zapata D, et al. Evaluation of a fluorescence polarization assay for the diagnosis of bovine brucellosis in Mexico[J]. Prev Vet Med, 1999, 40(1): 67-73. DOI: 10.1016/S0167-5877(99)00004-5

[12]Nielsen K, Gall D, Smith P, et al. Fluorescence polarization assay for the diagnosis of bovine brucellosis: adaptation to field use[J]. Vet Microbiol, 2001, 80(2): 163-170. DOI: 10.1016/ S0378-1135(00)00386-2

[13]Nielsen K, Smith P, Gall D, et al. Validation of the fluorescence polarization assay for detection of milk antibody toBrucellaabortus[J]. J Immunoassay Immunochem, 2001, 22(3): 203-211. DOI: 10.1081/IAS-100104706

[14]Gall D, Nielsen K, Bermudez MR, et al. Fluorescence polarization assay for detection ofBrucellaabortusantibodies in bulk tank bovine milk samples[J]. Clin Diagn Lab Immunol, 2002, 9(6): 1356-1360. DOI: 10.1128/CDLI.9.6.1356-1360.2002

[15]Gall D, Nielsen K, Forbes L, et al. Validation of the fluorescence polarization assay and comparison to other serological assays for the detection of serum antibodies toBrucellaabortusin bison[J]. J Wildlife Dis, 2000, 36(3): 469-476. DOI: 10.7589/0090-3558-36.3.469

[16]Schumaker BA, Corso BA, Rhyan JC, et al. Evaluation of the fluorescence polarization assay for the detection ofBrucellaabortusantibodies in bison in a natural setting[J]. Comparat Immunol Microbiol Infect Dis, 2010, 33(6): e119-e125. DOI: 10.1016/j.cimid.2010.07.001

[17]Montagnaro S, Longo M, Mallardo K, et al. Evaluation of a fluorescence polarization assay for the detection of serum antibodies toBrucellaabortusin water buffalo (Bubalusbubalis)[J]. Vet Immunol Immunopathol, 2008, 125(1): 135-142. DOI: 10.1016/j.vetimm. 2008.05.017

[18]Ramirez-Pfeiffer C, Nielsen K, Marin-Ricalde F, et al. Comparison of fluorescence polarization assay with card and complement fixation tests for the diagnosis of goat brucellosis in a high-prevalence area[J]. Vet Immunol Immunopathol, 2006, 110(1): 121-127. DOI: 10.1016/j.vetimm.2005.09.011

[19]Minas A, Stournara A, Minas M, et al. Validation of fluorescence polarization assay (FPA) and comparison with other tests used for diagnosis ofB.melitensisinfection in sheep[J]. Vet Microbiol, 2005, 111(3): 211-221. DOI: 10.1016/j.vetmic.2005.10.009

[20]Stournara A, Minas A, Bourtzi-Chatzopoulou E, et al. Assessment of serological response of young and adult sheep to conjunctival vaccination with Rev-1 vaccine by fluorescence polarization assay (FPA) and other serological tests forB.melitensis[J]. Vet Microbiol, 2007, 119(1): 53-64. DOI: 10.1016/j.vetmic.2006.08.004

[21]Ramirez-Pfeiffer C, Diaz-Aparicio E, Rodriguez-Padilla C, et al. Improved performance ofBrucellamelitensisnative hapten overBrucellaabortusOPS tracer on goat antibody detection by the fluorescence polarization assay[J]. Vet Immunol Immunopathol, 2008, 123(3): 223-229. DOI: 10.1016/j.vetimm.2008.02.001

[22]Ramirez-Pfeiffer C, Diaz-Aparicio E, Gomez-Flores R, et al. Use of theBrucellamelitensisnative hapten to diagnose brucellosis in goats by a rapid, simple, and specific fluorescence polarization assay[J]. Clin Vaccine Immunol, 2008, 15(6): 911-915. DOI: 10.1128/CVI.00046-08

[23]Nielsen K, Gall D, Smith P, et al. Validation of the fluorescence polarization assay as a serological test for the presumptive diagnosis of porcine brucellosis[J]. Vet Microbiol, 1999, 68: 245-253. DOI: 10.1016/S0378-1135(99)00077-2

[24]Silva Paulo P, Vigliocco A, Ramondino R, et al. Evaluation of primary binding assays for the presumptive diagnosis of swine brucellosis in Argentina[J]. Clin Diagn Lab Immunol, 2000, 7: 828-831. DOI: 10.1128/CDLI.7.5.828-831.2000

[25]Gall D, Nielsen K, Forbes L, et al. Evaluation of the fluorescence polarization assay and comparison to other serological assays for detection of brucellosis in cervids[J]. J Wildlife Dis, 2001, 37(1): 110-118. DOI: 10.7589/0090-3558-37.1.110

[26]Gwida M, El-Gohary A, Melzer F, et al. Comparison of diagnostic tests for the detection ofBrucellaspp. in camel sera[J]. BMC Res Notes, 2011, 4(1): 525. DOI: 10.1186/1756-0500 -4-525

[27]Lucero NE, Escobar GI, Ayala SM, et al. Fluorescence polarization assay for diagnosis of human brucellosis[J]. J Med Microbiol, 2003, 52(10): 883-887. DOI: 10.1099/jmm.0.05217-0

[28]Zhu GH, Zheng H, Ju HX. Development of fluorescence polarization immunoassay[J]. Chin J Analyt Chem, 2004, 32(1): 102-106. (in Chinese)

朱廣華,鄭洪,鞠熀先.熒光偏振免疫分析技術的研究進展[J].分析化學,2004,32(1):102 -106. DOI:10.3321/j.issn:0253-3820.2004.01.026