miRNA在缺血性心臟病中的研究進展

范致星 楊 簡

(三峽大學心血管病研究所 三峽大學第一臨床醫學院心內科,湖北 宜昌 443003)

缺血性心臟病(IHD)是人類健康的主要殺手，已成為世界第一位的死亡原因〔1〕。當IHD發生發展時，外周血中心肌肌鈣蛋白(cTn) 、肌酸激酶同工酶(CK-MB) 等心肌損傷標志物就會大量升高，特別是cTn對IHD的早期診斷和治療提供了依據。但cTn一般在IHD患者具有典型胸痛癥狀3.5 h后才會有明顯的升高，由于這種相對“延遲”的釋放，當被檢測出時，心肌可能已經發生不可逆的損傷，因而尋找一種特異性和敏感性高且時間更早的標志物具有十分重要的作用〔2〕。近年來相關研究發現〔3〕，外周血miRNA可作為潛在的生物標志物用于IHD的診斷。本文將闡述外周血miRNA本身的特點，對miRNA在IHD早期診斷及預后評估中的意義進行綜述。

1 miRNA概述

成熟miRNAs是一類長度約為22nt 廣泛存在于真核生物的非蛋白質編碼小RNA，由Dicer 酶對具有發夾結構的約70～90個堿基大小的單鏈RNA 前體加工后生成。這些非編碼小分子RNA與靶基因mRNA 分子的3'端非編碼區域(3'UTR) 互補配對后，可以通過降低mRNA 分子穩定性和翻譯抑制兩種方式參與靶基因表達調控〔4〕。第一個miRNA(lin-4)是Lee 等〔5〕于1993 年首先在線蟲中發現的。截至目前，已發現了千余種人類miRNA，隨著研究的深入還將有新的miRNA 被發現。最新研究表明〔3〕，miRNA可穩定存在于人類外周血中，作為生物標志物用于肌肉損傷(心肌)、炎癥等多種疾病的研究。

1.1體內miRNA的分布 一個理想的IHD標志物除了對特異性和敏感性的要求外，還應具有以下特點〔6〕：①存在易于獲得的樣本中(如血液、尿液)，便于取材；②能在所取樣本中穩定存在；③能用相對經濟、簡單的方法進行檢測。Hanson 等〔7〕在血液、精液、唾液、陰道分泌物及月經血中均檢測到miRNA 的表達。Gilad 等〔8〕對人體尿液、唾液、羊水及胸水檢測時，同樣發現了大量miRNA的存在。由此可見，體內miRNA的分布十分廣泛，但相對而言外周血中的含量更高。Mitchell等〔9〕找到了外周血中存在miRNA的直接證據，研究者從健康志愿者血漿中提取RNA后，發現其中93% 是已知的miRNA。這說明以miRNA為IHD生物標志物時只需抽血檢測即可。miRNA 釋放進入外周循環的機制尚不清楚，目前主要考慮有三種不同的途徑:從受損細胞滲透入循環(例如心肌損傷或心肌梗死后，心肌細胞內miRNA 異常表達并釋放到血液循環中)；由細胞主動分泌入循環；微泡分泌理論〔10〕。

1.2外周血miRNA的穩定性 新近的研究發現，血漿中的miRNA 穩定性良好〔11〕。Mitchell 等〔9〕發現 miRNA不會被內源性RNA 酶降解而穩定存在于人血漿中。相關研究還發現〔12〕，血清中的miRNA 能耐受高溫、凍融、過酸過堿等惡劣的條件且miRNA的種類與性別無關。Rosenfeld 等〔13〕對經甲醛液固定、石蠟包埋多年的標本進行提取和檢測，仍然能得到保存完好的miRNA。這些均有利于臨床設定一個比較固定的參照值進行檢測分析。

1.3外周血miRNA 的檢測 血清和血漿中miRNA 的表達不存在差異，因此在臨床實踐中可通過提取血清或血漿來檢測miRNA。同時,鑒于外周血miRNA的穩定性,無論是新鮮血液還是以其他方式保存的血液,均可用于檢測。外周血miRNA 的定性檢測可以采用miRNA 芯片技術〔9〕。除此之外，還有一系列的定量檢測方法：①利用RNA 提取試劑盒，這種方法能夠方便而快速地從全血、血清或血漿中直接提取RNA進行檢測〔14〕；②實時熒光逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)技術和莖環RT-PCR檢測技術〔15〕。莖環RT-PCR檢測技術精確度可在25 pg以內,且在特異性和敏感性方面更具優勢。

2 miRNA 作為IHD生物標志物

從臨床角度看，敏感性、特異性更高，峰值時間更早的生物標志物有助于改進目前IHD的診治。

2.1miRNA 作為IHD診斷生物標志物 外周血中多種miRNA 亞型都會在心臟缺血時發生濃度的改變。Wang等〔16〕發現，在IHD的實驗模型和心肌缺血的患者血漿中，miRNA-1、miR-133a、miRNA-499 和miRNA-208 的含量均較對照組或健康志愿者顯著升高，其中miRNA-208對IHD的診斷的敏感性和特異性最高。在IHD患者中，miRNA-208具有90.9%敏感性及100.0%特異性，且在癥狀出現的最初4 h內敏感性更高。Wang等〔16〕通過對IHD模型大鼠和IHD患者心肌內miRNA 表達規律的研究發現，miRNA-208在1 h內即可有高表達，3 h時出現峰值，6～12 h后逐漸下降，24 h后消失。這說明了miRNA-208在作為IHD早期診斷標志物時較常規生物標志物具有峰值時間更早的優勢。因此，miRNA-208可作為一種新的IHD早期診斷生物學指標。D'Alessandra等〔17〕發現心肌梗死患者外周血中的miRNA-1的上調與cTnⅠ水平相關，且具有相同的峰值時間。Cheng等〔18〕在大鼠心肌梗死模型及臨床心肌梗死患者的研究中獲得相似的結果，發現miRNA-1在心肌梗死后迅速表達，并在梗死后6 h達到高峰，3 d后降至基線水平。以上研究均提示miRNA-1亦可能作為IHD新的生化標記物。此外，Adachi等〔19〕對急性冠脈綜合征病人進行研究發現，miRNA-499僅在急性心肌梗死后明顯升高且對心肌有高度的特異性。這意味著miRNA-499可預期同cTnⅠ、CK-MB一樣能對IHD做出早期診斷。

2.2miRNA作為IHD預后生物標志物 近期研究開展了對IHD患者治療前后外周血miRNA 動態變化的相關研究，以便探討miRNA 在疾病預后評估中的意義。IHD患者進行運動康復治療后，Taurino 等〔20〕發現血中miRNA-92a與miRNA-92b 濃度增高，這一發現可能為IHD康復治療提供新的判定標準。與此同時，miRNA與心力衰竭之間關系的研究發現〔21〕，當心力衰竭患者治療好轉后，患者外周血中表達上調的多個不同的miRNA恢復或接近正常水平。這些研究表明miRNA 在疾病預后評估中也有著重要的意義。

綜上，目前，miRNA作為IHD生物標志物仍處于發展初期，利用miRNA 作為生物標志物檢測仍然存在許多問題，如費用較高、可重復性較低等。關于miRNA 在IHD的發生、發展中的作用和機制的研究有待進一步深入。同時，作為生物標志物miRNA早期診斷和評價預后的作用是否更優于現有的生物標志物如cTn等，還有待進一步研究。

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