飼料中二惡英檢測(cè)方法研究進(jìn)展

李曉敏， 張慶華， 王 璞

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，北京海淀 100081；2.中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心，北京海淀100085）

二惡英是多氯代二苯并-對(duì)-二惡英（PCDDs）和多氯代二苯并呋喃（PCDFs）兩大類化合物的統(tǒng)稱，是第一批被列入《斯德哥爾摩公約》的12種典型持久性有機(jī)污染物（POPs）中的兩類，因具有強(qiáng)致癌性、生殖毒性、內(nèi)分泌干擾毒性和生物蓄積性而備受關(guān)注（Johnson，1995）。

二惡英是工業(yè)生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物，主要來(lái)源于含氯化學(xué)品制造、市政垃圾焚燒、三廢排放以及廢舊電子垃圾拆解焚燒過程 （鄭明輝等，1999），其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，難以降解，能通過各種途徑進(jìn)入食物鏈。由于二惡英毒性大，易在動(dòng)物體內(nèi)蓄積的特性，其在低濃度下也易對(duì)人類和動(dòng)物產(chǎn)生健康影響，因此，在痕量水平上分析二惡英成為研究飼料中該類化合物的基礎(chǔ)。

1 飼料中二惡英的分析方法及限量標(biāo)準(zhǔn)

二惡英前處理效果直接影響檢測(cè)結(jié)果的靈敏度和準(zhǔn)確性（Malavia等，2007）。如何從不同基質(zhì)中分離二惡英并對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確定性定量分析是開展該類化合物研究的基礎(chǔ)。上世紀(jì)70年代末，基于同位素稀釋-高分辨氣相色譜/高分辨質(zhì)譜（isotope dilution-HRGC/HRMS）的二惡英分析方法已趨于成熟，在測(cè)定一些痕量及超痕量濃度水平樣品時(shí)，該方法是目前唯一具有法律效力的檢測(cè)方法。我國(guó)正在運(yùn)行的二惡英檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室大多采用歐美和日本等國(guó)家機(jī)構(gòu)頒布的標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)二惡英進(jìn)行分析檢測(cè)，如USEPA 1613b被廣泛用于檢測(cè)環(huán)境、食品樣品中痕量二惡英 （EPA，1994a），EN 1948用于檢測(cè)飛灰中二惡英 （EN-1948-1，2，3：2006），USEPA 8290 用于檢測(cè)固體廢棄物中二惡英等（EPA，1994b）。

目前，我國(guó)也已制定基于同位素稀釋-HRGC/HRMS的飼料中二惡英類化合物的檢測(cè)方法，該方法涵蓋眾多飼料產(chǎn)品：包括飼料原料、配合飼料、濃縮飼料、精料補(bǔ)充料、添加劑預(yù)混合飼料以及飼料添加劑等，已于2012年11月1日正式開始實(shí)施（GB/T 28643-2012）。

盡管目前對(duì)飼料中二惡英類化合物的檢測(cè)方法仍以HRGC/HRMS方法為確證方法和主要方法，但在大量篩選樣品時(shí)，為降低分析成本，一些實(shí)驗(yàn)室也采用生物方法進(jìn)行初步判定。本文中介紹的前處理技術(shù)和檢測(cè)方法也適用于多種基質(zhì)，包括飼料、食品、環(huán)境基質(zhì)、生物樣品等。

1.1 二惡英前處理技術(shù) 二惡英分析難點(diǎn)在于其含量低（可達(dá)fg/g水平）、易受基質(zhì)效應(yīng)干擾，而飼料和生物組織基質(zhì)復(fù)雜，干擾物眾多，并且這些干擾物水平一般遠(yuǎn)高于目標(biāo)化合物。在二惡英實(shí)際分析檢測(cè)工作中常出現(xiàn)檢測(cè)限高、回收率低的情況。此外，由于目前國(guó)際通用的HRGC/HRMS法中，高分辨質(zhì)譜極易受到高濃度樣品污染，因此，為得到更低的樣品檢出限，避免儀器污染和其他雜質(zhì)干擾，二惡英的前處理過程要求極為嚴(yán)格。

索氏提取法是較為經(jīng)典的持久性有機(jī)污染物提取方法，目前許多二惡英實(shí)驗(yàn)室仍然采用這種方法對(duì)樣品進(jìn)行萃取。隨著前處理技術(shù)發(fā)展，其他新型樣品提取方法，如加壓液體萃取法（PLE）和微波輔助萃取法（MAE）等開始被廣泛應(yīng)用于多種樣品基質(zhì)的提取中 （Rawa-Adkonis等，2003）。

利用色譜填料法對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理是常見的樣品前處理凈化技術(shù)。常見的二惡英前處理凈化填料有：氧化鋁、活性炭、硅膠、弗羅里土以及部分填料的變性材料等。USEPA 1613b方法對(duì)液體和固體樣品、多重復(fù)雜基質(zhì)樣品和組織樣品的前處理建立了詳細(xì)流程，但同時(shí)指出，在保證質(zhì)量的基礎(chǔ)上，各實(shí)驗(yàn)室可對(duì)該方法進(jìn)行改進(jìn)或優(yōu)化。此外，凝膠滲透色譜（GPC）經(jīng)常被用于分離樣品基質(zhì)中的脂肪和大分子共流出干擾物（Zacs等，2013；Rossetti等，2012）；在一些復(fù)雜基質(zhì)中，當(dāng)2，3，7，8-位取代的同系物被干擾或者樣品中存在難以通過色譜法去除的雜質(zhì)時(shí)，通常采用HPLC（high-performance liquid chromatography）對(duì)樣品進(jìn)行進(jìn)一步分離 （Engwall等，1997；EPA，1994a）；C18/硅膠填料的SPE柱可用于對(duì)生物基質(zhì)樣品的快速前處理凈化（Chang等，1990）。除常見色譜填料外，濃硫酸常被用于去除提取物中的脂肪和其他有機(jī)干擾物，銅粉通常被用于去除提取物中的硫。

目前國(guó)際上已有全自動(dòng)二惡英前處理設(shè)備。FMS公司開發(fā)的 fluid management systems（FMS）全自動(dòng)凈化系統(tǒng)，通過三根成品凈化柱（硅膠柱、氧化鋁柱和碳柱）的凈化，實(shí)現(xiàn)二惡英類化合物（二惡英和多氯聯(lián)苯）的分離，處理后的樣品經(jīng)濃縮后可直接進(jìn)行HRGC/HRMS測(cè)定。該方法性能穩(wěn)定、重現(xiàn)性好，滿足USEPA 1613b標(biāo)準(zhǔn)的要求。同時(shí)，F(xiàn)MS前處理技術(shù)可大幅提高分析速度，使分析周期大大縮短。但這種方法存在儀器和耗材昂貴的缺點(diǎn)，而且受通道數(shù)量限制，一次性處理樣品數(shù)量有限。

1.2 儀器檢測(cè)方法

1.2.1 HRGC/HRMS 利用氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用（GC/MS）測(cè)定多種基質(zhì)中的二惡英是分析這類化合物常見的方法（Katami等，2002；Roy 等，2002）。基于氣相色譜的分離能力和質(zhì)譜對(duì)特定離子的選擇性，GC/MS方法要優(yōu)于早期使用的其他方法（如GC/ECD、紅外等）。但是，環(huán)境樣品中毒性最強(qiáng)的二惡英單體 2，3，7，8-TCDD， 含量水平為ppt甚至ppq級(jí)別，受檢測(cè)限限制，GC/MS仍然無(wú)法對(duì)其定性定量。Baughman和Meselson（1973）優(yōu)化了二惡英前處理方法，利用HRMS對(duì)2，3，7，8-TCDD 進(jìn)行檢測(cè)，將檢測(cè)限降到 1.0 ppt的水平。此后，同位素稀釋-HRGC/HRMS方法被廣泛應(yīng)用于對(duì)環(huán)境樣品（土壤、空氣、水、底泥）、生物樣品（組織、內(nèi)臟、血液、胎盤、乳液）和食品中二惡英類化合物的檢測(cè)（Hernandez等，2012），同時(shí)，該方法也被公認(rèn)為二惡英檢測(cè)的“黃金法則”。我國(guó)國(guó)標(biāo)中對(duì)飼料中二惡英類化合物檢測(cè)方法即采用此方法。

雖然HRGC/HRMS法可以實(shí)現(xiàn)二惡英單體的定性定量檢測(cè)，但HRGC/HRMS法仍然存在一些缺點(diǎn)：如該方法的樣品前處理過程復(fù)雜，檢測(cè)周期長(zhǎng)，對(duì)分析儀器、實(shí)驗(yàn)室環(huán)境和操作人員的要求較高，分析成本極為昂貴等。此外，由于二惡英化合物單體眾多，且單體間物理化學(xué)性質(zhì)極為相近，因此很難在一根色譜柱上實(shí)現(xiàn)所有單體的分離；與二惡英性質(zhì)相近的多氯聯(lián)苯（PCBs）、芳香烴類化合物也會(huì)對(duì)二惡英分析造成干擾。一般解決方法是先后利用多根不同性質(zhì)的色譜柱重復(fù)進(jìn)樣，多次進(jìn)行分析（EPA，1994a）。 一些常見的色譜柱，如 DB-5ms（5%苯基-95%二甲基聚硅氧烷）、DB-Dioxin（44%甲基-28%苯基-20%氰丙基聚氧硅烷-8%聚乙二醇）、SP 2331（100%氰丙基聚氧硅烷）以及與其涂層類似的色譜柱都可被用于分離二惡英不同單體（Eljarrat和 Barcelo，2002）。

1.2.2 其他儀器檢測(cè)方法 為解決單根色譜柱分離二惡英共流出的現(xiàn)象，科研人員嘗試?yán)镁哂懈哽`敏度的全二維氣相色譜技術(shù)（GC×GC）分離檢測(cè)二惡英類化合物 （Eljarrat和 Barcelo，2002）。GC×GC法能獲得較窄的色譜峰譜圖，該方法可提高柱效，減少分析時(shí)間，改善結(jié)構(gòu)相似污染物色譜峰的分離度，提高污染物監(jiān)測(cè)的準(zhǔn)確性。同時(shí)，多種色譜柱交叉使用可避免復(fù)雜的色譜柱更換、重復(fù)進(jìn)樣操作 （Focant等，2004；Kemmochi等，2003）。因 GC×GC 系統(tǒng)需要配備快速檢測(cè)器，因而一般與TOF/MS、ECD、MS等檢測(cè)器連接（Eljarrat和 Barcelo，2002）。其中利用 GC×GC-TOF/MS系統(tǒng)對(duì)二惡英進(jìn)行檢測(cè)已有眾多研究報(bào)道（Hoh 等，2008；Focant等，2005）。GC×GCTOF/MS的分辨率可達(dá)5000～7000，雖然低于HRMS，但可同時(shí)進(jìn)行全掃描和選擇離子掃描檢測(cè)。雖然目前利用這種方法對(duì)二惡英檢測(cè)還比較少見，但其操作簡(jiǎn)便，仍具有一定應(yīng)用前景。受掃描速度限制，HRMS一般難與GC×GC匹配。但在最近一項(xiàng)研究中，Patterson等（2011）將GC×GC與高分辨質(zhì)譜搭載對(duì)人體血清中二惡英進(jìn)行分析，對(duì)HRMS參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，在保證儀器靈敏度的前提下減少質(zhì)譜掃描時(shí)間，可得到血清樣品中 1，2，3，7，8-PeCDD 單體（223 ag）的信噪比為 188∶1。

氣相色譜-三重四級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜法 （GC-MS/MS）也常被用于對(duì)二惡英類化合物的檢測(cè)。由于該方法對(duì)前處理要求低于傳統(tǒng)的HRGC/HRMS法，且具有優(yōu)異的選擇性和靈敏度，因此應(yīng)用也較為廣泛，尤其適用于一些含量較高的樣品（Cunliffe 和 Williams，2006；Eppe 等，2004；Tondeu 等，1987）。 Malavia等（2007）利用 GC-MS/MS 測(cè)定植物油中的PCDD/Fs和PCBs，結(jié)果顯示二惡英檢測(cè)限可達(dá)到0.04～0.20 pg/g。但GC-MS/MS的檢測(cè)限受基質(zhì)干擾較大，當(dāng)被用于測(cè)定土壤中PXDD/PXDFs（X=Br，Cl）時(shí)，檢測(cè)限（3.8 ～ 44 pg/g）遠(yuǎn)高于 HRGC/HRMS的結(jié)果 （Myers等，2012）。GC-MS/MS與HRGC/HRMS方法相比較，具有更好的選擇性，但其靈敏度要低于后者。

1.3 生物/免疫檢測(cè)方法 傳統(tǒng)儀器檢測(cè)方法準(zhǔn)確可靠，但前處理過程復(fù)雜、消耗大量化學(xué)試劑和耗材，分析成本高、周期長(zhǎng)，無(wú)法同時(shí)處理大量樣品。生物/免疫檢測(cè)方法（Bioassay/Immunoassay methods）是針對(duì)傳統(tǒng)儀器分析方法的缺點(diǎn)而發(fā)展起來(lái)的二惡英檢測(cè)技術(shù)。Nebert（1972）提出二惡英類物質(zhì)受體致毒機(jī)制以來(lái)，基于2，3，7，8位取代的二惡英單體與芳香烴受體（AhR）特異性結(jié)合的毒理學(xué)研究以及檢測(cè)方法開發(fā)一直是該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。其原理是利用與二惡英具有特異性結(jié)合位點(diǎn)的抗體、受體、酶，借助其對(duì)二惡英化合物的識(shí)別能力，通過測(cè)定生物分子活化程度，從而間接確定二惡英毒性當(dāng)量。生物/免疫檢測(cè)方法的優(yōu)點(diǎn)是檢測(cè)時(shí)間短、操作簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉，與同位素稀釋/高分辨方法相比可將分析成本降低50%以上 （Reiner等，2006）。隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，美國(guó)EPA已將幾種生物檢測(cè)方法推薦為指導(dǎo)方法。歐盟也將細(xì)胞的生物檢測(cè)法（cel1-base bioassay）和利用試劑盒的生物檢測(cè)法（kit-base bioassay）作為二惡英篩選方法（European Commission，2002a）。 生物法測(cè)試周期短，可平行測(cè)試大量樣品，適于快速、大規(guī)模樣品的篩選，缺點(diǎn)是只能測(cè)定總毒性當(dāng)量（Behnisch等，2001a）。目前常見的二惡英生物檢測(cè)方法包括：EROD酶 （7-乙氧基-3-異吩惡唑酮-脫乙基酶）活力誘導(dǎo)法、熒光素酶報(bào)告基因法（CALUX）、酶免疫分析法（EIA）、熒光免疫分析法（DELFIA）等（Behnisch 等，2001b）。

EROD酶與二惡英結(jié)合存在良好的時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。當(dāng)AhR與TCDD構(gòu)成的復(fù)合體進(jìn)入細(xì)胞核后，可與芳香烴受體核轉(zhuǎn)位子蛋白再度結(jié)合并識(shí)別特定DNA片段，與之結(jié)合后可啟動(dòng)下游靶基因轉(zhuǎn)錄，激活EROD酶的活性。因此通過測(cè)定EROD酶活性可間接獲得TCDD與AhR結(jié)合水平。研究表明，在一定范圍內(nèi)，EROD酶活與二惡英濃度呈線性關(guān)系。與免疫方法和熒光素酶方法相比，EROD法在測(cè)定CYP1A1基因催化活性時(shí)，結(jié)果更接近動(dòng)物體內(nèi)真實(shí)反應(yīng)。作為較早開發(fā)的二惡英生物檢測(cè)法，EROD應(yīng)用較為廣泛，如曾被用于研究雌雄魚體肝臟組織中化合物二惡英暴露差異（balos等，2010），以及大鼠肝臟和脂肪組織中二惡英時(shí)間劑量代謝關(guān)系（ábraham等，1988）。Schoffer等（2011）用 EROD（H4IIE 細(xì)胞株）法和HRGC/HRMS法測(cè)定雞肉中二惡英，并用回歸模型對(duì)其進(jìn)行校正，結(jié)果顯示該方法可被用于篩選動(dòng)物產(chǎn)品中二惡英超標(biāo)樣品。但使用EROD方法易造成假陰性結(jié)果，其測(cè)定線性范圍也較CALUX略窄（Behnisch 等，2001a）。

CALUX方法是目前發(fā)展較快的二惡英快速測(cè)定方法。與EROD方法相比，CALUX方法具有更高的靈敏度，且其檢測(cè)的線性范圍更寬，所需時(shí)間更短，目前已廣泛用于對(duì)多種環(huán)境介質(zhì)、生物樣品和食品中二惡英的檢測(cè)，適合大量樣本的快速篩選。由于CALUX法是特異性測(cè)定樣品中所有具有AhR受體的化合物，所以其受到的干擾較儀器分析法更為復(fù)雜，樣品提取、凈化以及樣品基質(zhì)均會(huì)給分析帶來(lái)較大影響，一般CALUX得出的結(jié)果會(huì)高于儀器分析結(jié)果 （Windal等，2005）。 周志廣等（2001）利用 CALUX 法測(cè)定廢氣中二惡英類化合物，并用HRGC/HRMS方法對(duì)分析結(jié)果進(jìn)行校正，結(jié)果顯示兩種方法得出的數(shù)值相差較大，但是兩種方法相關(guān)性良好（R2=0.9948）。

EIA法通過將特異性抗體與二惡英結(jié)合，將化合物固定在EIA管壁上，利用競(jìng)爭(zhēng)酶與樣品中二惡英共同競(jìng)爭(zhēng)抗體的特異性結(jié)合位點(diǎn)的原理，以不同濃度二惡英為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，最終通過測(cè)定抗體與競(jìng)爭(zhēng)酶的熒光強(qiáng)度反向推算二惡英濃度水平。該方法操作簡(jiǎn)便，價(jià)格低廉，可平行測(cè)定多個(gè)樣品，有商品化的試劑盒，便于采集樣品后在現(xiàn)場(chǎng)迅速完成測(cè)定。但該方法開發(fā)費(fèi)用昂貴，非特異性干擾較多，無(wú)法獲得化合物對(duì)生物活性的影響，而且對(duì)二惡英和多氯聯(lián)苯需采取不同的EIA方法。

生物/免疫分析法的缺點(diǎn)主要表現(xiàn)在：（1）不能添加回收內(nèi)標(biāo)，因此無(wú)法計(jì)算回收率；（2）只能得到總TEQ數(shù)據(jù)，無(wú)法確知單體的含量和TEQ值；（3）生物/免疫法屬于半定量方法，可能出現(xiàn)結(jié)果誤判。在處理具有爭(zhēng)議的結(jié)果時(shí)，仍須儀器方法進(jìn)行確證。因此，生物/免疫法一般用于大量樣品的篩選或含量較高的樣品的測(cè)定以及無(wú)需對(duì)單體進(jìn)行定量的情況。

2 研究前景

我國(guó)對(duì)二惡英類化合物的研究工作起步較晚，特別是對(duì)飼料和農(nóng)產(chǎn)品中二惡英的研究較少，對(duì)復(fù)雜飼料基質(zhì)中二惡英的檢測(cè)尚需進(jìn)一步研究。在對(duì)飼料中二惡英的檢測(cè)方面，短期內(nèi)，仍將以同位素稀釋-高分辨氣相色譜/高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀定性定量為主；生物檢測(cè)方法因其低成本和高通量的特點(diǎn)，也將會(huì)日漸推廣開來(lái)。從長(zhǎng)遠(yuǎn)來(lái)看，一些新型儀器，如APGC（atmospheric pressure gas chromatography）-MS/MS等都具有較好的研發(fā)前景，極有可能以其相對(duì)低廉的成本和與高分辨磁質(zhì)譜相似的靈敏度與分辨率逐漸在二惡英檢測(cè)中得到應(yīng)用。

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