藍莓花色苷對人臍靜脈內皮細胞分泌活性氧的影響

盧新衛 冷吉燕 杜 健 李修英

(吉林大學白求恩第一醫院，吉林 長春 130021)

動脈粥樣硬化(AS)已成為嚴重危害人類健康和生命的心血管疾病之一。近年來普遍認為各種主要危險因素終將造成動脈內膜損傷，而粥樣硬化斑塊的形成是動脈對內膜損傷作出反應〔1〕。ROS能誘導各種類型的細胞發生損傷和凋亡，主要包括NO、O2-、H2O2、過氧亞硝酸鹽陰離子(ONOO-)。在血管壁，ROS由AS斑塊處巨噬細胞形成，在單核細胞、白細胞黏附后作用于內皮細胞，參與AS的發生與發展。因此，減少ROS的分泌、抑制內皮細胞的氧化損傷，可能是預防AS發生和發展的重要靶點。研究表明〔2〕，黃酮類植物化合物大多具有明顯的抗氧化生物活性，保護內皮細胞主要通過以下機制：抗氧化和清除自由基，促進膽固醇逆向轉運，調節血管緊張度，抑制炎癥反應等。藍莓果實富含花青素和花色苷，從其果實中提取的藍莓花色苷同屬于黃酮類化合物，本實驗探討藍莓花色苷對內皮細胞的保護作用及其可能的機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞與主要試劑 人臍靜脈血管內皮細胞株(HUVEC)(吉林大學白求恩醫學院藥理學實驗室)、藍莓花色苷(本課題組先期提取，并已經鑒定)、DMEM高糖培養基(美國Gibco公司)、胎牛血清(FBS)(美國Hyclone公司)、AngⅡ(美國Sigma公司)、二甲基亞砜(DMSO)(美國 Sigma 公司)、3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)(美國 Sigma 公司)、鹽酸鹽緩沖液(PBS)。

1.1.2主要實驗器材 低溫高速離心機(美國 Thermo公司)、超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術有限公司)、MCO-20AIC型二氧化碳培養箱(日本SANYO公司)、CKX41型倒置顯微鏡(日本Olympus公司)、流式細胞儀(美國BD公司)、細胞計數板(上海求精生化試劑儀器有限公司)、細胞培養板96孔板(美國 Corning 公司)、ROS試劑盒(碧云天生物技術研究所)。

1.2方法

1.2.1HUVEC的培養、傳代與鑒定 從液氮罐中取出裝有HUVEC的凍存管，放入37℃水浴箱中不斷搖晃，1 min內迅速解凍細胞懸液，隨即于超凈臺內移入無菌離心管，加入2 ml DMEM高糖培養液，吹打均勻后，1 000～1 200 r/min離心3～5 min，棄上清后，再加入DMEM高糖培養液2 ml，吹打成細胞懸液，種入含10%FBS的DMEM高糖培養液的25 ml培養瓶內，置于37℃含5%CO2孵箱中培養，次日可見細胞貼壁生長，換液。3～5 d長滿瓶底90%，用0.25%胰蛋白酶消化、傳代，傳代后隔天換液，取對數生長期細胞為實驗對象。用Ⅷ因子相關抗原(SP免疫細胞化學染色法)檢測陽性鑒定為內皮細胞。

1.2.2實驗細胞分組及預處理 培養瓶中HUVEC生長至60%左右融合，換無血清培養液培養24 h，使細胞同步化，細胞分組處理：(1)空白對照組(Control)：HUVEC用含10%FBS+DMEM高糖培養液培養。(2)AngⅡ誘導組(AngⅡ)：HUVEC分別用10-9、10-8、10-7、10-6、10-5、10-4mol/L AngⅡ+10% FBS+DMEM高糖培養液培養。(3)藍莓花色苷組(BBA)：HUVEC分別用80、40、20、10、5、2.5 μg/ml藍莓花色苷+10%FBS+ DMEM高糖培養液培養。(4)AngⅡ+藍莓花色苷干預組(AngⅡ+BBA)：HUVEC在含有20 μg/ml藍莓花色苷的培養液中孵育2 h后，再加入10-6mol/L AngⅡ，共同孵育24 h。上述各組細胞均置于5%CO2、37℃、飽和濕度培養箱中培養。

1.2.3MTT法檢測HUVEC活性 取對數生長期HUVEC一瓶，超凈臺內用PBS洗滌2次，用0.25%胰蛋白酶消化獲得細胞后計數，設定每孔接種細胞數為5×103個，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養液配成單細胞懸液；無菌條件下將細胞懸液按200 μl/孔接種于96孔培養板內。5%CO2、37℃、飽和濕度培養箱中培養24 h，待細胞貼壁后，吸去培養液；根據上述不同的實驗設計分組加藥，設不加細胞不加藥組為調零孔；培養一定時間后，每孔加入MTT溶液(5 mg/ml)20 μl，37℃繼續培養3～4 h后，可見有紫藍色的甲臜結晶形成，小心吸取孔內上清液，棄去后每孔加入150 μl DMSO溶液，搖床上充分振蕩10 min，溶解結晶；選擇490 nm波長，在酶標儀上測定各孔吸光值(OD)值，并記錄結果。以上實驗至少重復3次。

1.2.4ROS的測定 取對數生長期的細胞，消化后以7×104/ml細胞懸液接種于96孔板中，次日給藥，每組設6個復孔。給藥24 h后，吸取各孔內上清液并棄去，用PBS洗2遍后，每孔中加入100 μl PBS，按照-80℃ 5 min，室溫下融化，反復凍融3次，收集50 μl上清液備用。按照ROS測定試劑盒說明書嚴格操作，測定胞內ROS水平。

1.3統計學分析 采用SPSS13.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1AngⅡ對HUVEC增殖活性的影響 給藥24 h后各濃度AngⅡ對HUVEC的增殖都有抑制作用，有一定的濃度依賴性，濃度≥10-6mol/L時對HUVEC的增殖抑制作用更加顯著。與空白對照組比較，AngⅡ濃度為10-6mol/L時細胞增殖被抑制了27%(P<0.01)；給藥48 h后，AngⅡ誘導組各濃度對HUVEC的增殖都有抑制作用，有明顯的劑量依賴，與空白對照組比較，AngⅡ濃度為10-6mol/L時細胞的增殖被抑制了32%(P<0.01)。選取10-6mol/L作為AngⅡ最適實驗濃度。

2.2藍莓花色苷對HUVEC增殖活性的影響 給藥24 h后，低濃度藍莓花色苷可輕度增加 HUVEC的活性；呈濃度依賴性，當濃度≥40 μg/ml時出現抑制作用，也有一定的濃度依賴性；與空白對照組比較，最高濃度使細胞增殖抑制了11%(P<0.01)；給藥48 h后，藍莓花色苷濃度≥40 μg/ml時對HUVEC的增殖亦有抑制作用，與空白對照組比較，最高濃度時細胞的增殖被抑制了16%(P<0.01)。本實驗選取20 μg/ml作為藍莓花色苷的最適實驗濃度。

2.3藍莓花色苷對HUVEC內ROS的影響 藍莓花色苷干預組HUVEC胞內ROS的水平下降，抑制了胞內ROS的產生。

3 討 論

內皮細胞位于血管壁的最內層，不僅是血管的保護屏障，更是人體內最大的內分泌器官，其合成與釋放的舒血管活性物質與縮血管活性物質對維持正常的血管功能尤其是血管舒縮狀態至關重要。內皮細胞通過分泌ROS、NO、PGI2以及ET、AngⅡ等血管活性肽調節血管張力〔3〕。內皮依賴性收縮和舒張因子的失衡可導致內皮細胞功能損傷和障礙，多種疾病如高血壓病、糖尿病、代謝綜合征、腫瘤以及炎癥等與內皮功能障礙具有密切關系〔4〕。縮血管因子AngⅡ是腎素-血管緊張素-醛固酮系統(RAAS)的重要組成部分，AngⅡ通過血管緊張素Ⅱ1型受體(AT1R)誘導凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體-1(LOX-1)的表達，而LOX-1的激活能上調AT1R的表達，ACEI則能抑制NADPH氧化酶的活化，減少ROS的生成〔5，6〕。研究表明，氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)誘導的LOX-1表達與ROS-NF-κB信號途徑激活存在正反饋效應〔7〕。

藍莓花色苷是從藍莓果實中提取的一種黃酮類化合物，具有抗氧化、清除自由基〔8〕，降低血脂等作用，對心血管系統有保護作用〔9，10〕。隨著細胞培養和免疫組化技術的發展，黃酮類植物化合物在多種代謝性疾病，如動脈粥樣硬化、高血壓、糖尿病等的作用機制研究也將越來越深入。

4 參考文獻

1陳灝珠.循環系統疾病內科學〔M〕.第7版.北京：人民衛生出版，2008:268.

2Linsel-Nitschke P, Tall AR. HDL as a target in the treatment of atherosclerotic cardiovascular disease〔J〕. Nat Rev Drug Discov,2005;4(3):193-205.

3Feletou M, Kohler R, Vanhoutte PM. Endothelium-derived vasoactive factors and hypertension: possible roles in pathogenesis and as treatment targets 〔J〕. Curr Hypertens Rep,2010;12(4):267-75.

4Higashi Y, Sasaki S, Nakagawa K,etal.Endothelial function and oxidative stress in renovascular hypertension〔J〕. N Engl J Med,2002;346(25):1954-62.

5Ghiadoni L, Magagna A, Versari D,etal. Different effect of antihypertensive drugs on conduit artery endothelial function〔J〕.Hypertension,2003;41(6):1281-6.

6Yoshida J, Yamamoto K, Mano T,etal. AT1 receptor blocker added to ACE inhibitor provides benefits at advanced stage of hypertensive diastolic heart failure〔J〕. Hypertension,2004;43(3):686-91.

7Sun Y, Chen X. Ox-LDL-induced LOX-1 expression in vascular smooth muscle cells: role of reactive oxygen species 〔J〕. Fund Clin Pharmacol,2011;25(5):572-9.

8Seeram NP, Momin RA, Nair MG,etal. Cyclooxygenase inhibitory andantioxidant cyanidin glycosides in cherries and berries〔J〕. Phytomedicine,2001;8(5):362-9.

9Abidov M, Jimenez Del Rio M, Ramazanov A,etal. Efficiency of pharmacologically-active antioxidant phytomedicine Radical Fruits in treatment hypercholesteremia at men〔J〕. Georgian MedNews,2006;140:78-83.

10de Pascual-Teresa S, Moreno DA, García-Viguera C. Flavanols and anthocyanin in cardiovascular health: a review of current evidence〔J〕. Int J Mol Sci,2010;11(4):1679-703.