CD4+CD25highCD127low/-調節性T細胞在多發性骨髓瘤患者外周血的表達

高 鵬 王雪野 肖中平 付 堃 孔令環 王雪梅 李凌君 封 韜 韓 梅

(吉林省人民醫院血液科，吉林 長春 130021)

多發性骨髓瘤(MM)好發于老年人，是一種單克隆漿細胞惡性增殖的血液系統惡性腫瘤，我國MM發病率約為1/10萬。多種免疫缺陷影響抗腫瘤免疫應答和免疫治療，因此了解MM患者的免疫功能狀態有利于改善患者預后，提高免疫治療的有效性。腫瘤的發生與機體免疫逃避有關，CD4+CD25+調節性T(Tregs)細胞是一群具有免疫負調控功能的T細胞亞群，在維持對自身成分免疫耐受的同時，也可能阻止了機體對自體腫瘤細胞的免疫，導致腫瘤的免疫抑制及免疫逃逸〔1〕，而在人類外周血中具有強大免疫調節活性的細胞主要限于CD4+CD25highT細胞亞群。本研究分析MM患者不同階段外周血CD4+CD25highCD127low/-Tregs細胞的比例變化，探討其與MM發生、發展的關系。

1 材料與方法

1.1臨床資料 2012年1月至2014年6月我院血液內科收治的30例MM患者，診斷均符合中國診斷標準〔2〕。其中男20例，女10例，年齡56～78歲，中位年齡66歲。免疫球蛋白免疫分型：IgG 型11例、IgA 型14例、IgD 型1例、輕鏈型4例。其中初診患者8例，復發22例。接受含硼替佐米方案聯合化療者17例，不含硼替佐米方案聯合化療者7例，未治療6例。含硼替佐米化療方案包括硼替佐米、地塞米松、阿霉素、環磷酰胺，即PAD、BCD、BD。不含硼替佐米化療方案包括美法侖(馬法蘭)、潑尼松、沙利度胺、地塞米松、環磷酰胺、依托泊苷、順鉑，即MPT、TD、DCEP。MM 臨床分期按國際分期系統(ISS)分期〔3〕對確診患者評估，Ⅰ期：β2-微球蛋白(MG)<3.5 mg/L，血清白蛋白(Alb)≥3.5 g/dl；Ⅱ期：3.5 mg/L≤β2-MG<5.5 mg/L,Alb≥3.5 g/dl；Ⅲ期：β2-MG≥5.5 mg/L 。其中Ⅱ 期12例、Ⅲ 期18例。另取我院體檢中心健康體檢者年齡匹配的健康對照20例，男12例，女8例，年齡51～79歲，中位年齡65歲。均無腫瘤及自身免疫性疾病史。

1.2主要試劑和儀器 CD4-F1TC，CD25-PE，CD127-CY5，CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PC5抗體，OptiLyseC血細胞溶血劑，EPICS XL流式細胞儀為美國貝克曼-庫爾特公司產品。

1.3樣本的采集 均于清晨空腹抽取靜脈血2～4 ml，置于EDTA抗凝管中備用。化療病人于化療前1天和第3個療程化療(完成2個療程化療)前1天抽血，方法同上。

1.4細胞染色 (1)取外周血100 μl，置于流式檢測管中，分別加入不同熒光標記的單克隆抗體CD4-FITC，CD25-PE，CD127-CY5抗體各20 μl，充分混勻，室溫避光孵育15 min。(2)各管加入500 μl溶血劑，混勻，避光10 min，加入適量PBS，1 500 r/min離心5 min，棄上清，加500 μl PBS，用流式細胞儀檢測。

1.5流式細胞儀(FCM)分析 采用EPICS XL FCM進行檢測，結果分析應用EXPO32ADCXL4 Color軟件，在FSC-SSC散點圖上選定淋巴細胞群，以CD4設門，分析CD4+細胞上CD25和CD127表達，將CD4+CD25+細胞群平均熒光強度2倍的亞型細胞群定義為CD4+CD25highT細胞，分析CD4+T細胞上CD25highCD127low/-T 細胞的表達，計算CD4+CD25highCD127low/-T細胞的百分比。

1.6統計學處理 采用SPSS21.0統計軟件進行t檢驗和方差分析及q檢驗。

2 結 果

2.1兩組外周血CD4+CD25highCD127low/-T細胞水平比較 MM組CD4+CD25highCD127low/-Tregs細胞占CD4+細胞的百分比〔(4.06±1.03)%〕較健康對照組〔(1.38±0.54)%〕有顯著升高(P<0.01)。

2.2外周血CD4+CD25highCD127low/-Treg 細胞在不同分期MM患者的比較 MM組Ⅱ和Ⅲ期CD4+CD25highCD127low/-Treg細胞水平〔(2.47±0.69)%，(5.12 ±1.52)%〕均高于健康對照組(P<0.05)。Ⅲ期明顯高于Ⅱ期(P<0.05)。

2.3外周血CD4+CD25highCD127low/-Treg細胞在MM患者化療前后的比較 MM組含硼替佐米亞組化療后CD4+CD25highCD127low/-Tregs細胞數量〔(1.07±0.69)%〕較化療前〔(4.41±1.17)%〕明顯下降(P<0.01)。不含硼替佐米組化療后〔(2.34±0.45)%〕較化療前〔(4.05±1.02)%〕顯著下降(P<0.05)。兩組化療前無顯著差異，化療后差異明顯(P<0.05)。

3 討 論

MM約占血液系統惡性腫瘤的10%，是一種漿細胞異常增生的惡性腫瘤，骨髓瘤細胞起源于B記憶細胞或幼漿細胞。在腫瘤免疫中，細胞免疫發揮著十分重要的作用，T細胞亞群對機體的免疫應答調控和維持免疫穩定具有重要作用，其中CD4+T細胞是輔助T細胞，在免疫應答中是主要反應細胞。而CD4+CD25+Tregs是近年發現的CD4+T細胞中一種具有免疫抑制功能的細胞。

Sakaguchi等〔4〕發現在正常人和小鼠外周血及脾臟組織的CD4+T細胞中有一亞群持續高表達CD25分子(IL-2受體a鏈)的亞群，該群細胞是一類重要的免疫調節細胞，將其命名為CD4+CD25+Treg。它具有免疫無能性和免疫抑制性兩大特征〔5〕。CD4+CD25+Tregs是目前研究最多的Tregs群體，占人外周血CD4+T細胞總數的5%～10%〔6〕，其表面表達CD25、細胞毒T淋巴細胞相關抗原(CTLA)-4、糖皮質激素誘導的腫瘤壞死因子受體(GITR)和叉頭樣轉錄因子Foxp3等分子。目前有大量研究報道在眾多腫瘤患者的外周血中CD4+CD25+Tregs細胞增多〔7〕。因此，腫瘤患者細胞免疫功能削弱的機制之一，可能是由于CD4+CD25+Tregs比例增加。在人類，CD25的表達是連續的，即有低、中、高之分，但具有免疫抑制功能的調節性T細胞主要集中在高表達CD25的CD4+T細胞(即CD4+CD25highT細胞)中。

Hori等〔8〕發現，CD4+CD25+Treg能夠表達一種獨特的轉錄抑制因子Foxp3，Foxp3的表達是Treg特異的〔9〕，是CD4+CD25+Treg區別于活化T細胞的一個特異性標志。近期有研究結果表明〔10〕，調節性T 淋巴細胞下調表達CD127分子(IL-7受體)。Liu等〔11〕認為CD127(IL-7受體)也可以作為Treg的特異性標志。Foxp3對CD127的啟動子有抑制作用，因而Treg的CD127呈低表達。Foxp3高表達和CD127低表達之間存在良好的相關性，高表達Foxp3的Treg呈CD127低表達，以CD4、CD25及CD127為分子標志分離獲得的Treg純度遠高于以其他分子標志分離獲得的Treg。因此CD4+CD25highCD127low/-細胞群體更準確地反映了此Tregs群體，并且對于識別人類外周血CD4+CD25+Tregs更具有優勢〔12〕。

本研究采用CD4+CD25highCD127low/-T 細胞定義MM患者中的Tregs細胞，體現了CD4+CD25+T 細胞的典型特征，發揮其膜表面標志的特征及特異性，通過CD127的表達來有效地區分效應T細胞和Tregs細胞。本研究提示MM患者Tregs異常增高和腫瘤負荷相關，反映了惡性骨髓瘤細胞可能通過誘導Tregs的免疫抑制作用逃脫免疫監視。這可能是MM患者免疫功能下降、免疫逃逸的重要機制。與大部分其他癌癥患者的檢驗結果相一致，Beyer等〔13〕認為Treg細胞數量升高導致MM患者免疫力低下可能的原因是，Treg細胞通過分泌抑制性細胞因子，如IL-10、轉化生長因子(TGF)-β及與其他細胞的間接接觸等途徑，抑制了效應性T細胞的活化增殖，從而達到抑制機體抗腫瘤的免疫反應。Prabhala等〔14〕提出Treg細胞的功能受損可能是通過IL-6途徑引起的。由于CD4+CD25+T細胞是一種Treg細胞，在維持自身免疫耐受方面發揮著重要作用，所以它在人類腫瘤中的價值也受到重視，充分發揮Treg細胞的免疫調節作用，有可能改善MM患者的免疫狀態，提高機體免疫力，為腫瘤免疫治療提供參考。細胞免疫功能異常可能在MM發病機制中起著重要作用。Treg細胞水平的增高與疾病的嚴重程度呈正相關，可反映MM 的惡性程度，并可作為檢測MM疾病進展及判斷預后的輔助指標。本文表明化療對Tregs比例有影響，提示化療后患者免疫功能有所恢復，可能對患者體內Tregs的變化起著重要作用。化療藥物如環磷酰胺、沙利度胺、雷利度胺等已被證實具有清除MM患者Treg細胞的作用〔15〕。硼替佐米可通過抑制核因子(NF)-κB通路抑制T細胞增殖、活化，應用硼替佐米治療移植物抗宿主病(GVHD)的實驗證實該藥對人體外周血Treg細胞有清除作用〔16〕。

綜上，目前大劑量化療聯合造血干細胞移植的微小殘留病狀態下，適當地去除MM患者體內Tregs或阻斷其活性，而又不致于誘發自身免疫病的發生，可能會提高免疫治療的有效性，為腫瘤的免疫治療提供一條新途徑，有望成為根治MM的方法之一。

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