RNA干擾技術在醫學領域的應用

鄭 露，周 劍

（重慶市食品藥品檢驗所·重慶市藥物過程與質量控制工程技術研究中心，重慶 401121）

RNA干擾技術（RNA interference，RNAi）是正常生物體內抑制特定基因表達的一種現象，是指當細胞中導入與內源性mRNA編碼區同源的雙鏈RNA時，通過一系列細胞內反應引起細胞中mRNA發生降解而導致基因表達沉默。RNA干擾現象最早可追溯到20多年前。1990年為加深矮牽牛花的紫色，有人[1]導入了一個強啟動子控制的色素基因，可是結果與預期相反，許多花瓣顏色并未加深，反而呈雜色甚至白色。這是由于轉基因和同源的內源基因的表達都被抑制了，Jorgensen把這個現象命名為共抑制（cosuppression）。這種基因抑制是發生在轉錄后水平的，因此又稱為轉錄后基 因沉默 （post－ transcriptional gene silencing，PTGS）。2001年，Elbashir等[2]在哺乳動物細胞中用化學合成的21nt的雙鏈 RNA(double－stranded RNA，dsRNA)誘導產生了特異性 RNAi，RNAi技術迅速擴展到哺乳動物領域。1995年，Guo等[3]在試圖阻斷秀麗新小桿線蟲（C.elegans）中的 par－1基因時，發現了正義與反義 RNA同樣能切斷 par－1基因的表達。1998年，Fire等[4]在利用反義RNA進行線蟲基因阻斷時，發現雙鏈RNA能夠引起的mRNA降解，于是將這一現象稱為RNAi。

1 原理

RNAi的作用機制被認為包括起始階段、效應階段、擴增和擴散階段[5]。

起始階段：較長的dsRNA在ATP參與下被RNaseⅢ樣的特異核酸酶切割加工成21～23 nt的由正義和反義鏈組成的小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）。siRNA 的兩條單鏈末端為 5′磷酸和 3′羥基，且 3′端均有 2～3個突出的核苷酸。果蠅中的RNaseⅢ樣核酸酶稱為 Dicer。Dicer有解旋酶活性并含有 dsDNA結合域和PAZ結構域。Dicer的類似物相繼在擬南芥、秀麗線蟲及哺乳動物等機體中被發現。

效應階段：siRNA在ATP參與下被RNA解旋酶解旋成單鏈，并由其中反義鏈指導形成RNA誘導的沉默復合體（RNA－induced silencing complex，RISC）。活化的 RISC在單鏈 siRNA引導下識別互補的信使核糖核酸(messenger RNA，mRNA)，并在 RISC中的核酸內切酶作用下從siRNA引導鏈中心所對應的靶基因位置切割靶mRNA，最后可能再被核酸外切酶進一步降解，從而干擾基因表達。RNAi能高效特異地阻斷基因的表達，在線蟲，果蠅體內，RNAi能達到基因敲除的效果。

擴增和擴散階段：siRNA不僅可引導RISC切割靶RNA，而且可作為引物在RNA依賴的RNA聚合酶作用下以靶mRNA為模板合成新的dsRNA。新合成的長鏈dsRNA同樣可被RNaseⅢ樣核酸酶切割、降解而生成大量的次級siRNA。次級siRNA又可進入合成、切割的循環過程，進一步放大RNAi作用。這種合成、切割的循環過程稱為隨機降解性聚合酶鏈反應（random degradative，PCR）。

2 應用

2.1 抗病毒

病毒善于變異，適應性強，且感染的場所是在細胞內，故病毒感染性疾病較難治愈，一直以來是威脅人類健康的主要因素。RNAi為抗病毒研究提供了一個重要的策略。目前，人們用RNAi技術在人免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒等的多種抗病毒研究中取得了很多進展。Randall等[6]證明了針對HCVRNA的siRNA轉染細胞4 d后可使細胞質中復制的HCV－RNA降低80倍；Kapadia等[7]也證明了 siRNA特異抑制 HCV－RNA復制、阻止相關蛋白表達的作用。

2.2 腫瘤的基因治療

用RNAi特異性地抑制癌基因、癌相關基因或突變基因的過度表達，使這類基因保持在靜默或休眠狀態，從而有望用這種新的手段治療各種惡性腫瘤。目前，發現促癌基因的激活、雜合等位基因的喪失及與腫瘤生物學特性相關基因的表達異常等因素與腫瘤發生發展密切相關。這些異常表達基因的蛋白產物與正常組織細胞的同類蛋白并無差異，因此在蛋白水平抑制它們的表達，不能很好地區分正常細胞和惡性腫瘤細胞。但這些基因變異往往反應在mRNA水平上，故siRNA很可能成為能夠特異作用于腫瘤的理想抗癌藥物。Calin GA等[8]首次證明了miRNA在某些類型的白血病和淋巴瘤患者體內發生了功能障礙，其中2種 miRNA（miR215和miR216）起著關鍵作用。癌基因ras在大約20%的癌癥中因突變而發生了過表達或活化。Johnson等[9]發現ras受Let－7家族的調控，其中包括線蟲的 ras基因、人的 k－ras、h－ras和 n－ras基因。Takamizawa J等[10]首次發現了let－7 miRNA在肺癌中低表達。最近，Hayashita Y等[11]又發現了一個與肺癌相關的miRNA簇——miR－17－92，miR－17－92在多數肺癌細胞株中過量表達，而且導入外源miR－17－92可顯著促進肺癌細胞的生長。He L等[12]證實，miR－17－92在B細胞淋巴瘤中也呈高表達狀態。由于RNAi具有高度的特異性并能高效調節其靶基因的表達，近年用RNAi技術在多種不同的腫瘤細胞中成功干擾了多種靶基因的表達，抑制了腫瘤細胞的生長，已成為目前腫瘤治療的研究熱點。

2.3 心血管疾病治療中的應用

有學者已將RNA干擾技術成功運用于先天性心臟病、擴展性心肌病、病毒性心肌炎、心力衰竭、心肌肥厚等，如成簇粘附激酶（focaladhesionkinase，FAK）信號通路在心肌肥大中起了重要作用。Clemente等[13]將針對 FAK的siRNA通過頸靜脈注入小鼠體內，從而減少心肌纖維化，阻止了心肌的肥厚。

2.4 其他疾病治療中的應用

RNAi技術正越來越多被應用于其他許多疾病的治療研究。如內分泌系統中的糖尿病，血液系統中的鐮狀細胞性貧血，消化系統中的肝纖維化，呼吸系統中的急性肺損傷等。

2.5 藥物開發中的應用

RNAi技術作為尋找新的藥物靶標的工具，可以快速、大規模、高通量的對發現的藥物靶基因進行功能分析。同時，基因藥物具有高度的序列特異性和非常小的藥物不良反應，利用這個技術可以用于確定人類細胞中的疾病途徑，為小分子藥物篩選靶物質以及建立新的生物制藥方法和診斷學方法。

3 面臨的問題

效率不高的載體系統?；虻陌邢蜣D運未完全實現，成為RNAi技術能否進入臨床應用的關鍵問題。近年來在新型載體的開發、應用單鏈片段抗體技術選擇性導入siRNA及siRNA的化學修飾以提高生物穩定性等方面研究取得了一定的進展，有望加快突破這個障礙[14－15]。

RNAi的特異性是相對的。某些情況下siRNA能在翻譯水平抑制與之不完全相關的基因表達，即“脫靶”現象，須從siRNA的設計，siRNA的位置特異性修飾等方面研究解決的方法[16－17]。RNAi的具體分子機制研究。

RNAi機制本身受哪些因子調控，不同種生物是否沿用同一種RNAi機制，RNAi的生物功能研究等方面的認識還不足。

其他問題包括對基因認識的廣度和深度還難于滿足實際應用的需要，未實現在體內準確操控外源基因表達的時間性和空間性。

4 結語

隨著人類基因組計劃的完成，后基因組時代已經到來，基因功能的研究越來越重要。最近興起的RNA干擾技術，以其快速、簡便、高效的抑制基因表達受到科學家們極大的關注，成為基因治療的極具潛力的工具。目前RNA干擾在生物化學、分子生物學、制藥、醫學等各個領域得到了廣泛的應用，隨著技術的成熟，相信在不久的將來這一技術會在生命科學的領域中大有作為，成為遺傳學與分子生物學研究的有力工具。

[1]Wassenegger M.Gene silencing[J].Int Rev Cytol，2002，219：61.

[2]Elbashir SM，Harborth J，Lendeckel W，et al.Duplexes of 21 － nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mam.malian cells[J].Na-ture，2001，411（6 836）：494 － 498.

[3]Guo S，Kemphues KJ.Par－ 1，a gene required for establishing polarity in C.elegans embryos，encodes a putative Ser／Thr kinase that is asymmetrically distributed[J].Cell，1995，81(4)：611 － 620.

[4]Fire A，Xu S，Montgomery MK，et al.Potent and specific genetic interference by double－stranded RNA in Caenorhabditis elegans[J].Nature，1998，391(6 669)：806 － 811.

[5]Bühler M，Moazed D.Transcrip tion and RNAi in heterochromaticgene silencing[J].Nat Struct Mol Biol，2007，14（11）：1 041 － 1 048.

[6]Randall G，Panis M，Cooper JD，et al.Cellular cofactors affecting hepatitis C virus infection and replication[J].Proc Natl Acad Sci USA，2007，104（31）：12 884 － 12 889.

[7]Kapadia SB，Chisari FV.Hepatitis C virus RNA replication is regulated by host geranylgeranylation and fatty acids[J].Proc Natl Acad Sci USA，2005，102（7）：2 561 － 2 566.

[8]Calin GA，Dumitru CD，Shimizu M，et al.Frequent deletions and down －regulation of microRNA genes miR15 and miR16 at 13q14 in chronic lymphocytic leukemia[J].Proc Natl Acad Sci USA，2002，99(24)：15 524 －15 529.

[9]Johnson SM，Grosshans H，Shingara J，et al.RAS is regulated by the let－ 7 microRNA family[J].Cell，2005，120(5)：635 － 647.

[10]Takamizawa J，Konishi H，Yanagisawa K，et al.Reduced expression of the let－7 microRNAs in human lung cancers in association with shortened postoperative survival[J].Cancer Res，2004，64(11)：3 753 － 3 756.

[11]Hayashita Y，Osada H，Tatematsu Y，et al.A polycistronic microRNA cluster，miR －17－92，is overexpressed in human lung cancers and enhances cell proliferation[J].Cancer Res，2005，65(21)：9 628 － 9 632.

[12]He L，Thomson JM，Hemanm MT，et al.A microRNA polycistron as a potential human oncogene[J].Nature，2005，435(7 043)：828 － 833.

[13]Clemente CF，Tornatore TF，Theizen TH，et al.Targeting focal adhesion kinase with small interfering RNA prevents and reverses load－induced cardiac hypertrophy in mice[J].Circulation Res，2007，101（12）：1 339－1 348.

[14]MingKai X，ChengGang Z.Gene expression and function study of fusion immunotoxin anti－Her－2－scFv－SEC2 in Escherichia coli[J].Appl Microbiol Biotechnol，2006，70（1）：78 － 84.

[15]Chougn S，Kim YJ，Kim S，et al.Chemical modification of siRNAs to imp rove serum stability without loss of efficacy[J].Biochem Biophys Res Commun，2006，342（3）：919 － 927.

[16]Shabalina SA，Spiridonov AN，Ogurtsov AY.Computational models with thermodynamic and composition features improve siRNA design[J].BMC Bioinformatics，2006，7：65.

[17]Puthenveetil S， Whitby L， Ren J， et al.Controlling activation of the RNA－dependent proteinkinase by siRNAs using site－specific chemical modification[J].Nucleic Acids Res，2006，34（17）：4 900 － 4 911.