依達拉奉對帕金森病大鼠模型的神經保護作用及黑質紋狀體丙二醛和一氧化氮水平的影響

劉書芳

河南省漯河市中心醫院神經內科，河南漯河 462000

帕金森病（PD）是當前醫療研究的熱點之一[1]。氧化應激反應被認為是導致帕金森病的主要機制[2]。因此，保護機體神經組織并且盡量的防止氧化應激反應是帕金森病治療的關鍵[3]。依達拉奉作為一種有效的抗氧化劑[4]，近年來我校以PD大鼠為對象，發現依達拉奉對PD大鼠的神經保護作用和黑質紋狀體MDA、NO有一定的影響。現將有關結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 材料與儀器

成年健康雄性SD大鼠72只，體重（250±20）g，標準環境下飼養。抗壞血酸、阿撲嗎啡、抗絡氨酸羥化酶抗體、二氨基聯苯胺（DAB）、6-羥基多巴胺（上述材料均由美國Sigma公司提供）；SABC試劑盒（北京中杉金橋公司提供）；丙二醛試劑盒、一氧化氮試劑盒（南京建成公司提供）；依達拉奉（先聲東元公司提供）；BX50WI倒置顯微鏡（日本Olympus公司提供），MICRO4動物腦立體定位儀（美國WPI公司提供）。研究時間為2014年3月—2014年5月。

1.2 模型制作與動物分組

1.2.1 模型制作 選擇60只大鼠制作PD模型。腹腔麻醉，固定在動物腦立體定位儀，沿中線切開2 cm切口，暴露前囟，確定左側前腦內側束位置和鉆顱部位。鉆開直徑2 mm顱骨孔，微量進樣器進針至靶點。約10 min后，注入6-羥基多巴胺4μL，濃度為2μg/μL，速度為9 ng/s。注射完成后留針10 min，然后退針。明膠海綿堵塞顱骨孔，青霉素常規消毒、縫合皮膚，然后放回籠中。

1.2.2 動物分組 12只大鼠為健康正常組（ZC），不作任何處理。12只大鼠為生理鹽水組（YS），在PD模型制作完成30 min后，腹腔注射生理鹽水1 mL，2次/d，連續14 d。另48只PD大鼠為實驗組，在PD模型制作完成30 min后腹腔注射依達拉奉，濃度分別為0.3、1、3、3 mg/kg，記 0.3 mg 組、1 mg 組、3 mgA 組、3 mgB組。除 3 mgB組外，每日注射2次，持續14 d；3 mgB組持續28 d。

1.3 評價方法

1.3.1 旋轉實驗 ZC、YS、0.3g、1g、3gA 組在處理 14d、3gB 組在處理28d后腹腔注射阿撲嗎啡，標準為0.5mg/kg。注射5min后持續記錄30min。如PD模型大鼠在30min內旋轉次數大于210次，為制模成功。如制模不成功，重復1.2制模和分組過程。

1.3.2 組織學方法 復合麻醉劑深度麻醉后，快速灌注生理鹽水沖洗，然后快速灌注200 mL 4%甲醛，再緩慢灌注300 mL甲醛。斷頭取腦，置于4%甲醛，4℃冰箱固定4 h。然后依次置入20%、30%蔗糖磷酸鹽緩沖液，4℃冰箱直至腦塊沉入瓶底。取紋狀體、中腦組織行冠狀連續冰塊切片，作尼氏體染色，計算黑質內尼氏體細胞數。

1.3.3 神經生化學檢測 在大鼠斷頭后，快速取出大腦，分離出紋狀體和中腦黑質，4℃生理鹽水沖洗，濾紙拭干，置于-80℃超低溫冰箱。稱重后，剪碎組織塊，置于冰浴玻璃勻漿器勻漿。然后按照丙二醛、一氧化氮試劑盒操作要求，測定丙二醛和一氧化氮活性變化。

1.4 統計學處理

所有數據使用SPSS 19.0進行統計學處理。計量數據采用均數±標準差表示。LSD法檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各處理對大鼠旋轉次數與黑質內尼氏體細胞的影響

各處理對大鼠旋轉次數與黑質內尼氏體細胞數的影響見表1。0.3mg、1mg、3mgA、3mgB 組旋轉次數顯著低于 YS組，但是高于ZC組（P<0.05）。各處理右側黑質內尼氏體細胞數無統計學差異（P>0.05）。ZC組左側尼氏體細胞數最高，其次為3mgA和3mgB組，YS、0.3mg、1mg組左側尼氏體細胞數最少。

表1 各處理對大鼠旋轉次數與黑質內尼氏體細胞數的影響

2.2 各處理對丙二醛和一氧化氮含量的影響

各處理對丙二醛和一氧化氮含量的影響見表2。黑質與紋狀體中的一氧化氮和丙二醛含量均呈同一規律變化，ZC組的丙二醛含量與一氧化氮含量顯著低于其他各組（P<0.05）。3 mgA組和3 mgB組則顯著低于 YS、0.3mg和 1mg組（P<0.05）。

表2 各處理對丙二醛和一氧化氮含量的影響

3 討論

氧化應激反應被認為是導致帕金森病的主要原因[5]。目前多巴胺是治療帕金森病的主要藥物。但是長期服用將會導致運動波動、精神癥狀等，而且療效將會減退[6]。因此，急需尋找一種替代藥物。依達拉奉可以轉移電子，打破脂質過氧化反應鏈，實現神經細胞保護作用，同時也可以抑制氧化型細胞損害，防止血管內皮細胞損傷。另外，依達拉奉的親脂基團還可以清除羥自由基，抑制過氧化作用。從本研究的結果來看，依達拉奉可以減少誘發后的旋轉次數。尤其是隨著處理濃度的增大，旋轉次數明顯降低。在本研究中，3mgA組、3mgB組30min旋轉次數分別為 （210.13±9.56）、（206.42±8.81）次，顯著少于 YS組、0.3mg組和 1mg組。上述結果揭示了依達拉奉可以改善PD大鼠的行為。本研究結果與成亞琴,陳鑫,張元媛等[6]結論是一致的。在他們的報道中，發現3mg/Kg處理可以有效的減輕大鼠旋轉。他們認為這可能與DA神經元丟失減少、延緩了PD發展有關。從黑質體內尼氏體細胞數來看，各組右側尼氏體細胞數并無明顯差異，但是3mgA組和3mgB組左側尼氏體細胞數顯著少于ZC組，多于YS組和0.3mg組、1mg組，這揭示了左側尼氏體細胞數對PD大鼠行為具有一定的保護作用。依達拉奉則可以提升PD大鼠左側尼氏體細胞數。

一氧化氮和丙二醛被認為是過氧化反應的主要產物。從本研究的結果來看，注射依達拉奉后，雖然一氧化氮和丙二醛含量依然高于正常組（ZC），表明大鼠依然存在異常的過氧化作用，但是注射依達拉奉大鼠（3mg）的一氧化氮和丙二醛含量明顯低于未注射依達拉奉大鼠（YS組）。不過研究發現，依達拉奉注射量抑制過氧化作用的效果存在差異。高劑量（3mg/kg）組的抑制效果顯著好于低劑量組（0.3mg/kg、1mg/kg）。該結果表明了依達拉奉的使用劑量與過氧化抑制效果存在相關性。隨著依達拉奉使用量增高，過氧化抑制效果越好。本研究結果與文獻[5]、文獻[6]的報道結論是一致的。在文獻5、文獻6的報道中，認為依達拉奉具有較強的氧化過激反應抑制作用。抑制氧化過激反應則是治療PD的主要原則之一。

綜合而言，對PD大鼠注射依達拉奉，可以較好的保護神經，改善大鼠行為，抑制一氧化氮和丙二醛生成，防止機體過氧化作用，揭示了依達拉奉在帕金森病的治療中具有重要的價值。但是本研究結論是基于大鼠實驗，目前有關于人體試驗的報道尚未見到。依達拉奉是否對PD患者具有效果、具體的劑量、使用方法等都還是空白。這需要在以后進一步深入。

[1]熊珮,陳忻,張楠.帕金森病病理機制及中藥防治帕金森病實驗研究進展[J].中國中藥雜志,2012,37(5):686-691.

[2]張美蓉,孫芳玲,艾厚喜,等.帕金森病的炎癥及抗炎藥物的研究進展[J].中國康復理論與實踐,2012,18(11):1040-1043.

[3]陳鑫,成亞琴,施建生,等.依達拉奉對6-OHDA誘導的帕金森病大鼠黑質紋狀體神經元的保護作用[J].江蘇醫藥,2013,39(7):779-782.

[4]黃月,趙青贊,任秀花,等.依達拉奉對脂多糖誘導的PD大鼠模型神經保護作用的實驗研究[J].中風與神經疾病雜志,2011,28(1):53-54.

[5]吳二兵,陳鑫,張元媛,等.依達拉奉對6-OHDA誘導的帕金森病大鼠黑質紋狀體MDA、NO含量的影響[J].中風與神經疾病雜志,2013,30(9):781-784.

[6]成亞琴,陳鑫,張元媛,等.依達拉奉對帕金森病大鼠模型的神經保護作用及黑質紋狀體丙二醛和一氧化氮水平的影響[J].臨床神經病學雜志,2013,26(4):282-285.