腫瘤壞死因子α在超重者脂肪組織中的表達

何衡杰 郝 麗

安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，安徽合肥 230601

近年來許多研究證實了腫瘤壞死因子與胰島素抵抗有關(guān)，且肥胖者脂肪分泌的腫瘤壞死因子可能是正常者的數(shù)倍。但對于為數(shù)眾多的超重者，相關(guān)文獻相對較少。本實驗旨在觀察是否超重者脂肪組織也存在TNF-α基因表達增強，正常及超重者腹部皮下脂肪組織及網(wǎng)膜脂肪組織的TNF-α基因表達有無差異。

1 對象與方法

1.1 研究對象

均為在安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院普外科做手術(shù)的安徽漢族人，排除了感染、肝臟疾病及其他內(nèi)分泌代謝疾病等。實驗的分類標(biāo)準為《中國成人超重與肥胖癥預(yù)防與控制指南》，2003年該指南由中國肥胖問題工作組編寫，超重組19人，BMI在24～28 kg/m2之間，年齡為22～75歲，平均年齡 48.9歲;正常組 24人,BMI在18.5～24 kg/m2之間,年齡為 33～70歲，平均年齡為51.2歲；二組年齡及性別基本匹配。

1.2 方法

1.2.1 手術(shù)時取腹部皮下、網(wǎng)膜脂肪組織，取樣后用液氮迅速冷凍并低溫保存。按QIAGEN公司提供RNeasy Mini Kit試劑盒說明書要求提取脂肪組織總RNA。紫外分光光度儀測定及瓊脂糖電泳判斷RNA質(zhì)量。根據(jù)基因特異性cDNA序列，通過軟件primer 5.0設(shè)計特異性擴增引物，擴增TNF-α基因的特異性引物，上游序列為：5ˊ-GTGACAAGCCTGTAGCCCAT-3ˊ，下游序列為：5ˊ-TAGATGGGCTCATACCAGGG-3ˊ，擴增片段長度331bp；擴增β-actin基因的引物，上游序列為：5ˊ-GCTATCCAGGCTGTGCTATC-3ˊ，下游序列為：5ˊ-CAGCACTGTGTTGGCGTACA-3ˊ，擴增片段長度495 bp。RT-PCR：總RNA2 uL，5倍逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)緩沖液4 uL,Oligo(dT)18 2.5 uL,RNA酶抑制劑0.5 uL,逆轉(zhuǎn)錄酶AMV 2 uL,dNTP 8 uL,加DEPC處理水至 20 uL,28℃放置 10 min，42℃溫育2 h，99℃5 min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。PCR反應(yīng)體系中包括：模板10 uL，10倍PCR反應(yīng)緩沖液5 uL，4種混合單核苷酸4 uL，腫瘤壞死因子上下游引物及β-actin上下游引物各1.0 uL,Taq酶0.7uL,加DEPC處理水至反應(yīng)總體積50 uL。第一步：94℃預(yù)變性1 min；第二步：30個循環(huán)即 94℃變性 32s，59.9℃退火 40s，72℃延伸 1 min；第三步：72℃再延伸4 min[1]。1.2%的瓊脂糖凝膠電泳反應(yīng)產(chǎn)物，通過凝膠成像分析系統(tǒng)來測定每個單獨條帶的亮度，并在此基礎(chǔ)上計算出條帶的光密度比值（TNF-α/β-actin），見圖1。

圖1 PCR產(chǎn)物電泳圖

0:分子量標(biāo)準DL 2,000;1-4:腹部皮下及網(wǎng)膜脂肪組織中TNF-α和β-actin基因PCR產(chǎn)物。

1.2.2 測身高、體重，腰圍（腰圍測量是以腋中線肋下緣與髂骨上緣間中點水平周長）、臀圍（臀圍為以恥骨聯(lián)合水平測量臀部的最大周長），并在以上的基礎(chǔ)上計算腰臀比例和體重指數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，組間比較采用t檢驗，相關(guān)因素采用線性相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 各組光密度比值之間的兩兩比較

TNF-α基因在超重組的皮下脂肪組織表達變化較正常組略有增強，但差異無顯著性(P＞0.05)；TNF-α基因在網(wǎng)膜脂肪組織的表達變化比正常組也略有增強，差異無顯著性(P＞0.05)；所以說，在超重組和正常組中，皮下與網(wǎng)膜的基因TNF-α表達變化的差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

2.2 TNF-α基因在皮下與網(wǎng)膜的表達與各指標(biāo)的雙變量相關(guān)性分析

皮下的 TNF-α 基因表達與 WC（γ=0.420,P＜0.05）、WHR（γ=0.416,P＜0.05）成正相關(guān);網(wǎng)膜的 TNF-α 基因表達與 WC（γ=0.360,P＜0.05）、WHR(γ=0.368,P＜0.05)成正相關(guān)；BMI、AGE 與兩種組織的TNF-α基因表達沒有相關(guān)性（見表1）。

表1 皮下與網(wǎng)膜的TNF-α基因表達與各指標(biāo)的雙變量相關(guān)分析

3 討論

脂肪組織的細胞在發(fā)生腫瘤時會表達和釋放一種產(chǎn)物叫腫瘤壞死因子，其中TNF-α基因可能存在兩種分泌途徑，即旁分泌和自分泌，從而刺激脂肪細胞發(fā)生分解消失，另外會通過減少LPL的生成并減弱其活性，從而生成脂肪細胞的能力變?nèi)酰€會通過干擾誘導(dǎo)前脂肪細胞的分化和刺激成熟脂肪細胞逆分化兩種方式來阻擾脂肪細胞發(fā)生分化，從而使得前脂肪細胞和脂肪細胞的凋亡速度加快，最終防止擴大了脂肪組織的整個體積[2-3]。

近年來，有一些關(guān)于TNF-α基因表達與肥胖和超重的研究。首先，前人發(fā)現(xiàn)在肥胖組的脂肪組織中TNF-α基因表達量有所增加，而隨著體重的減輕，基因TNF-α表達量隨之減少[4]。然而在對人類的研究上發(fā)現(xiàn)分歧：BMI為體重指數(shù)，其中BMI＞30kg/m2為超重組，BMI＜25 kg/m2為正常組，對兩組對比發(fā)現(xiàn)，超重組的皮下和細胞中TNF-a基因會過度表達，約為對照組中TNF-a基因表達的2.5倍[5]，Bullo等對96例婦女的研究表明，TNF-α基因表達與脂肪容量成比例關(guān)系[6]；但也有不同的結(jié)果，前人對39位體重指數(shù)各異的人為研究對象，結(jié)論是BMI與脂肪組織中TNF-α基因表達變化呈現(xiàn)出正相關(guān)只限于體重指數(shù)介于27～45kg/m2者，高度肥胖者則不在此列[7]；得出相反的結(jié)論是Koistinen和李曉男等的研究，顯示消瘦和肥胖者皮下脂肪組織的TNF-α基因基因表達基本無差異[8-9]，本實驗通過對19例超重者和24例對照者的研究顯示超重組皮下脂肪組織TNF-α基因表達比正常體重組略有增強，沒有統(tǒng)計學(xué)意義，與前人結(jié)果相符。但是還存在不同的研究結(jié)果，Montague等通過試驗發(fā)現(xiàn)人體腹部的皮下和網(wǎng)膜的TNF-α基因表達是一致的[10]；本實驗中網(wǎng)膜的TNF-α基因表達較正常組也略有增強，但同樣無顯著性差異；超重組與正常組的皮下與網(wǎng)膜之間的TNF-α基因表達比較發(fā)現(xiàn)，P值均大于0.05，差異不顯著，與Montague等的結(jié)果相符。兩組合并后相關(guān)分析顯示W(wǎng)C、WHR與在皮下及網(wǎng)膜中表達基因TNF-α的變化相關(guān)性為正向的，與BMI、AGE與此基因無相關(guān)性。提示兩種脂肪組織TNF-α基因表達隨中心性肥胖體型的趨勢而上升，并且和體重指數(shù)具有密切的關(guān)系。

本實驗通過對超重者19例和對照者24例的比較研究顯示：超重組皮下及網(wǎng)膜脂肪組織的TNF-α基因表達無明顯增強，無論是超重組還是正常組，皮下與網(wǎng)膜之間的TNF-α基因表達比較，不存在統(tǒng)計學(xué)意義。

[1]胡國平，劉鈴，王佑民,等.肥胖癥患者皮下和網(wǎng)膜脂肪組織中PPARγ2的表達與血漿瘦素、腫瘤壞死因子α和游離脂肪酸的關(guān)系[J].安徽醫(yī)學(xué)，2005（4）:257-260.

[2]孫暉.生活方式干預(yù)對胰島素抵抗大鼠脂肪組織腫瘤壞死因子α及其受體表達的影響[D].華中科技大學(xué)碩士學(xué)位論文，2007.

[3]曹艷麗.脂肪組織中腫瘤壞死因子-α與血漿纖溶酶原激活抑制物-1相關(guān)性的研究[D].安徽醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文，2008.

[4]鄭娜.4-羥基異亮氨酸抑制TNF-α表達改善胰島素抵抗[D].華中科技大學(xué)碩士學(xué)位論文，2013.

[5]Rupert Oberauer,Wolfgang Rist,Martin C.Lenter，et al.EGFL6 is increasingly expressed in human obesity and promotes proliferation of adipose tissue-derived stromal vascular cells[J].Molecular and Cellular Biochemistry,2010（343）:257-269

[6]Bullo M，Garcia-Lorda P，Peinado-Onsarbe J，et al.TNF alpha expression of subcutaneous adipose tissue in obese and morbid obese females:relationship to adipocyte LPL activity and leptin synthesis[J].Int J Obes Relat Metab Disord，2002,26(5):625-628.

[7]何衡杰.腫瘤壞死因子α在超重者脂肪組織中的表達[D].安徽醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文，2005.

[8]Koistinen HA,Bastard JP,Dusserre E，et al.Subcutaneous adipose tissue expression of tumour necrosis factor-alpha is not associated with who insulin resistance in obese nondiabetic or in type-2 diabetic subjects[J].Eur J Clin Invest，2000，30(4):302-310.

[9]李曉南，陳榮華，Tommy Olsson，et al.人類皮下和網(wǎng)膜脂肪組織脂肪細胞因子的表達[J].江蘇醫(yī)藥，2005（12）：914-916，880.

[10]Montague CT,Prins JB,Sanders L,et al.Depot-related gene expression in human subcutaneous and omental adipocytes[J].Diabetes,199 （47）:1384-1391.