藥品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法實(shí)驗(yàn)體會(huì)

劉恩思

藥品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法實(shí)驗(yàn)體會(huì)

劉恩思

鱟是海邊棲生的一種大型節(jié)肢動(dòng)物, 其多功能血細(xì)胞(變形細(xì)胞)的溶解物中含有一種可凝性蛋白質(zhì), 在極微量內(nèi)毒素(0.0005 vg/ml)存在時(shí)可形成凝膠。鱟試驗(yàn)法是利用此原理測(cè)定血液或其他樣品中的微量內(nèi)毒素的生物體外檢測(cè)技術(shù)。自從1964年美國學(xué)者發(fā)現(xiàn)鱟試驗(yàn)法以來, 因?yàn)槠渚哂锌焖佟⒑啽恪⒔?jīng)濟(jì)、靈敏度高、重現(xiàn)性好、一次可同時(shí)測(cè)幾個(gè)樣品等優(yōu)點(diǎn), 該法正被日益廣泛地應(yīng)用于檢測(cè)食品、水源、藥品、醫(yī)療器械、動(dòng)物體液等不同樣品中的內(nèi)毒素。在20世紀(jì)70年代初期, 我國學(xué)者對(duì)鱟試驗(yàn)法開始了研究。1991年, 衛(wèi)生部部版標(biāo)準(zhǔn)首次收載了細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法；1993年,《中國藥典》(1990年版)第二增補(bǔ)本正式收載該法, 《中國藥典》(2000年版)增加了細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則, 《中國藥典》收載使用該法的品種逐版增加, 《中國藥典》(2010年版)［1］增至416個(gè)品種。

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法靈敏度高, 受到許多因素的干擾。溶液pH值不適宜、二價(jià)陽離子不足、酶活性不足導(dǎo)致由內(nèi)毒素激活的酶反應(yīng)受抑制；內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品稀釋不當(dāng)、器具吸附、放置時(shí)間過長內(nèi)毒素自身聚集, 溫度、酸堿破壞引起的內(nèi)毒素?fù)p耗都會(huì)出現(xiàn)假陰性結(jié)果。除內(nèi)毒素外, β-葡聚糖也與鱟試劑發(fā)生反應(yīng), 生成凝膠, 出現(xiàn)假陽性結(jié)果。結(jié)合自己的工作體會(huì), 總結(jié)了鱟試驗(yàn)中的幾點(diǎn)注意事項(xiàng)。

1 鱟試劑

1.1鱟試劑靈敏度復(fù)核 《中國藥典》規(guī)定每批鱟試劑在用于試驗(yàn)前應(yīng)復(fù)核靈敏度。鱟試劑在生產(chǎn)、銷售、運(yùn)輸、貯藏、使用等過程中, 易受到外界因素的影響, 如溫度、光線、時(shí)間等, 使促凝活性降低。尤其是不同廠家或不同批號(hào)的產(chǎn)品不同生產(chǎn)廠家的鱟試劑, 即使標(biāo)示靈敏度相同, 檢測(cè)同一檢品時(shí), 也可能出現(xiàn)不同結(jié)果。因而先核對(duì)靈敏度可避免因鱟試劑造成的判斷失誤。

1.2美國藥典要求應(yīng)使用經(jīng)特殊制備、不與β-葡聚糖反應(yīng)的鱟試劑檢測(cè)含葡聚糖的樣品(如右旋糖酐20葡萄糖注射液、右旋糖酐40氯化鈉注射液等)。我國藥典沒有類似規(guī)定, 在鱟試劑選擇上要慎重。含葡聚糖的樣品若出現(xiàn)陽性結(jié)果, 應(yīng)高度重視, 使用抗增液復(fù)溶鱟試劑可排除這種干擾。

2 鱟試劑的正常反應(yīng)需中性的pH值、一定濃度的鈉離子和二價(jià)陽離子

2.1pH值 鱟試驗(yàn)的反應(yīng)混合液pH值應(yīng)在6~8范圍內(nèi)。用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水在容許范圍內(nèi)稀釋供試品。用酸、堿或緩沖液調(diào)節(jié)pH值。供試品稀釋倍數(shù)太大、內(nèi)毒素含量太低、鱟試劑靈敏度不夠, 造成假陰性結(jié)果。試驗(yàn)前一定要計(jì)算最大有效稀釋倍數(shù)。調(diào)節(jié)pH值使用強(qiáng)酸、強(qiáng)堿和pH劑。pH試紙準(zhǔn)確度不夠。弱酸、弱堿調(diào)節(jié)時(shí)用量較大, 可能引入較多的內(nèi)毒素。

2.2樣品中含有螯合劑時(shí), 使用硫酸鎂緩沖劑稀釋樣品可維持二價(jià)陽離子濃度。

2.3加熱或超濾可除去蛋白和酶的影響。

2.4實(shí)驗(yàn)器具 實(shí)驗(yàn)器具應(yīng)充分洗滌并沖洗干凈, 特別是接觸酸堿或用洗衣粉、洗液等洗滌后, 更應(yīng)沖洗干凈, 以免殘留物破壞極微量的內(nèi)毒素。避免使用對(duì)內(nèi)毒素有吸附作用的實(shí)驗(yàn)器具, 所以最好是使用專用器具。

2.5在內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品配制和使用過程中, 經(jīng)常使用漩渦混合器, 避免內(nèi)毒素自身聚集。內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液保存的溫度、時(shí)間、濃度應(yīng)經(jīng)驗(yàn)證確認(rèn), 若使用頻率低, 最好現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.6試驗(yàn)用的試管架最好專門定制, 孔徑應(yīng)與安瓿或試管直徑相接近, 避免左右晃動(dòng)。保溫過程中不可隨時(shí)取出觀察,防止試管受到振動(dòng)后造成凝膠變形而誤判為陰性。溫度對(duì)鱟試劑的靈敏度影響很大, 隨著溫度的升高以及延長保溫時(shí)間,鱟試劑的靈敏度亦增大, 增加假陽性。溫度過高會(huì)破壞鱟試劑。應(yīng)控制在(37±1)℃之間, 保溫(60±2)min。細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)定儀可以較好的滿足以上條件。

2.7操作時(shí)應(yīng)將手用酒精消毒, 安瓿開啟前應(yīng)先用砂石劃痕(不管是色點(diǎn)或包環(huán)易折安瓿), 用手半拉半掰將頸部折斷,千萬不能用鑷子敲擊, 防止碎玻屑掉入安瓿。在鱟試劑的溶解、樣品的稀釋及加入時(shí), 取樣均應(yīng)準(zhǔn)確, 緩緩加入避免氣泡。雙手避免在安瓿或試管的上方來回移動(dòng), 加樣后用封口膜迅速封閉管口, 操作要快, 否則易致假陽性的出現(xiàn)。

［1］ 國家藥典委員會(huì).中國藥典(一部).北京：中國醫(yī)藥科技出版社, 2010.

2014-05-05］

625000 雅安市食品藥品檢驗(yàn)所