真菌耐藥性及新型抗真菌藥物研究進(jìn)展

（江蘇省無錫市第二人民醫(yī)院，江蘇 無錫214002）

20世紀(jì)80年代起，由于廣譜抗生素的大量使用、HIV感染、癌癥化學(xué)治療和器官移植引起的免疫抑制患者增加等因素，真菌感染逐年上升[1]。同時(shí)隨著抗真菌藥物的大量使用，真菌的耐藥率持續(xù)上升，影響了藥物的治療效果[2]。因此，了解真菌耐藥性的發(fā)生機(jī)制及其耐藥性的現(xiàn)狀，對進(jìn)行新型抗真菌藥物的研究和開發(fā)具有十分重要的意義。抗真菌藥物按結(jié)構(gòu)類型大致分為唑類、多烯類、丙烯胺類、氟胞嘧啶類等，其中唑類藥物應(yīng)用最廣泛。在此以唑類藥物為重點(diǎn)，對抗真菌藥物的耐藥機(jī)制進(jìn)行綜述。

1 抗真菌藥物的耐藥機(jī)制

1.1 唑類抗真菌藥物

近年來關(guān)于真菌對唑類藥物的耐藥機(jī)制研究比較多。目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為其耐藥機(jī)制主要有：唑類藥物的靶酶14DM發(fā)生改變，包括基因突變導(dǎo)致靶酶與藥物的親和力降低，以及靶酶的過度表達(dá)[3]；耐藥菌細(xì)胞膜上外排泵基因的過度表達(dá)[4]。

1)唑類藥物的靶酶發(fā)生改變

目前已經(jīng)克隆得到編碼14DM的基因，并定為ERG11基因。ERG11基因的突變與過度表達(dá)均可使14DM結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而使藥物的作用靶點(diǎn)改變。對唑類耐藥的白色念珠菌菌株與敏感菌株進(jìn)行ERG11基因的DNA測序，經(jīng)比較可看出，在耐藥菌中存在突變點(diǎn)（R467K），是467位的精氨酸置換成賴氨酸[5]。進(jìn)一步研究提示，R467K突變可降低靶酶對氟康唑的親和力而產(chǎn)生耐藥性。在ERG11基因上存在另一個(gè)突變點(diǎn)T315A，將315位的蘇氨酸置換成丙氨酸。這種特殊的突變直接發(fā)生在酶的活性部位，即在血紅素的輔助因子上。Revankar有研究證實(shí)[6]，突變體的ERG11p酶的催化活性沒有改變，但對唑類藥物的親和力下降，顯示了靶酶基因ERG11發(fā)生突變與真菌的耐藥有一定的相關(guān)性。靶酶基因的過度表達(dá)可產(chǎn)生大量的靶酶，細(xì)胞內(nèi)藥物的濃度不能完全抑制靶酶的活性，從而使真菌產(chǎn)生耐藥性。Kudo等[7]的研究發(fā)現(xiàn)，在唑類耐藥的光滑念珠菌中，其麥角固醇的含量增加，主要是由于14DM表達(dá)增多，也證實(shí)了ERG11基因過度表達(dá)與念珠菌耐藥表型的關(guān)系。

2)耐藥菌細(xì)胞膜外排泵基因過度表達(dá)

在念珠菌中，藥物的外排泵出機(jī)制的改變是產(chǎn)生耐藥性的重要機(jī)制。各種外排泵基因過度表達(dá)將細(xì)胞內(nèi)的藥物排出胞外，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)藥物濃度降低從而不能有效抑制真菌的生長。主動(dòng)外排系統(tǒng)包括2大類，一類是三磷酸腺苷(ATP)結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)子家族（ATP Binding Cassette，ABC），如CDR基因；另一類是主要易化超家族（Ma—ior Facilitator Superfacilitater，MFS），如CaMDR及flul基因[8－9]。目前，至少有7個(gè)CDR基因已完成鑒定、測序，但體外試驗(yàn)結(jié)果顯示，CDR1及CDR2基因與對唑類的耐藥有關(guān)，其他的CDR基因與耐藥性不相關(guān)。CDR1基因編碼的跨膜蛋白，是一種ATP依賴性的轉(zhuǎn)運(yùn)子，可將小分子物質(zhì)進(jìn)行跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。Wada等[5]研究證實(shí)，CDR1基因與唑類的耐藥性之間確實(shí)存在密切關(guān)系。在耐藥念珠菌株中，CDR1基因的mRNA水平可增高5到8倍，說明CDR1基因在念珠菌產(chǎn)生對唑類藥物獲得性耐藥中的重要作用。CDR2p其氨基酸序列有84%與CDR1p的氨基酸序列相同。CDR2基因的高表達(dá)也與對抗真菌藥物的耐藥性有關(guān)，但CDR2基因介導(dǎo)的耐藥水平低于CDR1基因。

在白色念珠菌中，CaMDR1基因可編碼MFS轉(zhuǎn)運(yùn)子，即可產(chǎn)生跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MDR1p，該蛋白的功能為利用氫離子的跨膜濃度差，逆向轉(zhuǎn)運(yùn)底物，使菌株表現(xiàn)出對藥物的耐藥性。在一些白色念珠菌耐藥菌中，CaMDR1基因過度表達(dá)，而CDR1基因的表達(dá)水平維持正常，這提示CaMDR1表達(dá)增高與唑類耐藥密切相關(guān)，并且CaMDR1對唑類藥物具有選擇性，CaMDR1基因的過度表達(dá)與氟康唑有關(guān)，而與酮康唑、伊曲康唑無關(guān)[10]。

真菌對唑類藥物高度耐藥是逐漸發(fā)展的，由幾種耐藥機(jī)制共同作用，最終導(dǎo)致真菌出現(xiàn)耐藥表型。Calabrese等[11]對耐藥白色念珠菌的流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，85%的耐藥株為外排泵過度表達(dá)；35%的耐藥株為藥物靶酶的改變；75%的耐藥株為多因素聯(lián)合耐藥。耐藥表型的出現(xiàn)通常是多種因素共同作用的結(jié)果，而且菌株過長時(shí)間暴露于一種唑類藥物中會導(dǎo)致不同唑類藥物之間的交叉耐藥。

1.2 多烯類抗真菌藥物

多烯類藥物的作用機(jī)制是直接與真菌細(xì)胞膜上的固醇類物質(zhì)麥角甾醇相結(jié)合，在細(xì)胞膜上形成水性孔道，增加細(xì)胞膜的通透性，使菌體內(nèi)重要物質(zhì)外滲，最終引起細(xì)胞死亡。盡管多烯類藥物在臨床上應(yīng)用30年，但其繼發(fā)性耐藥較少見，多局限于一些不常見的菌種，如洛西坦尼念珠菌、吉利蒙念珠菌等。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，真菌對多烯類的耐藥性與細(xì)胞內(nèi)麥角甾醇的含量減少有關(guān)。細(xì)胞膜中缺少麥角甾醇的真菌變種常對多烯類藥物有耐藥性，其細(xì)胞膜中的主要甾醇成分已不是麥角甾醇。在對兩性霉素B耐藥的白色念珠菌突變體中，可發(fā)現(xiàn)麥角甾醇的含量有74%～85%的下降。進(jìn)一步研究證實(shí)，在杜氏利什曼原蟲中兩性霉素B的耐藥性，就是由于細(xì)胞膜中另外一種固醇替代了麥角甾醇，影響了細(xì)胞膜的流動(dòng)性，并且改變后細(xì)胞膜對兩性霉素B的親和力較低[12]。

1.3 其他類抗真菌藥物

丙烯胺類藥物包括特比萘芬、萘替芬等，氟胞嘧啶類的代表藥物為5－氟胞嘧啶，目前這些藥物在臨床上有一定的應(yīng)用范圍，耐藥性產(chǎn)生情況也有進(jìn)一步的研究。雖然特比萘芬的治療失敗已有報(bào)道，但由于藥物的臨床應(yīng)用所引起的真菌獲得性耐藥尚未發(fā)現(xiàn)。然而，隨著藥物的廣泛應(yīng)用，耐藥性的產(chǎn)生是不可避免的。Hsiao等[13]發(fā)現(xiàn)，一些對氟康唑耐藥的光滑念珠菌表現(xiàn)出對特比萘芬的交叉耐藥。而且，CDR基因的產(chǎn)物與特比萘芬之間存在著交互作用。另外，真菌細(xì)胞內(nèi)藥物含量下降，靶酶與藥物的親和力的下降都與耐藥性的產(chǎn)生有關(guān)。丙烯胺類的耐藥性機(jī)制已在一些酵母菌中發(fā)現(xiàn)，而在皮膚真菌中卻沒有檢測到任何明顯的耐藥情況。目前，這類藥物多用于淺表性真菌感染治療。單獨(dú)應(yīng)用5－氟胞嘧啶抗真菌治療時(shí)，有10%～15%的真菌可產(chǎn)生耐藥性，目前其耐藥機(jī)制正在進(jìn)行廣泛研究。對白色念珠菌的基因組學(xué)研究證實(shí)，氟胞嘧啶類的耐藥性是由特殊菌株的基因型所決定的隱性特征，在菌株的遺傳位點(diǎn)上存在著耐藥基因FCY（FCY為顯性，fcy為隱性）。因此，F(xiàn)CY/FCY菌株對氟胞嘧啶敏感，其尿嘧啶磷酸核苷轉(zhuǎn)移酶（UPRT酶）活性高（大約為3U）；部分耐藥的菌株表示出耐藥基因的雜合子FCY/fcy，其UPRT酶活性減弱（大約為1.5U）；雜合子進(jìn)一步突變將產(chǎn)生耐藥表現(xiàn)型fcy/fcy，其UPRT酶幾乎沒有活性。基因分析已顯示有兩個(gè)基因定位FCY1和FCY2可以突變產(chǎn)生5－氟胞嘧啶耐藥。

2 新型抗真菌藥物

2.1 唑類藥物的優(yōu)化和開發(fā)

最近幾年，唑類藥物的衍生物已經(jīng)發(fā)展成為一類具有極大發(fā)展?jié)摿Φ目拐婢幬铮F(xiàn)有超過15種新型唑類化合物正處于研究階段，其中以伏立康唑（Voriconazole）為代表。體外試驗(yàn)表明，它對于念珠菌、新生隱球菌等都有良好的抑制活性；對一些霉菌如曲霉菌、鐮刀菌、莢膜組織胞漿菌等也有抑制作用；但對接合菌無效[14－16]。

2.2 降低多烯類的毒副作用

多烯類藥物其抗菌作用強(qiáng)，然而該藥嚴(yán)重的副作用如中毒性腎損害和急性輸入毒性等，使其臨床應(yīng)用受限。近年來，對兩性霉素B的改良主要集中于對新劑型的設(shè)計(jì)，目前已有3種不同的脂質(zhì)體劑型供臨床使用，兩性霉素B脂質(zhì)體（L－AmB）、兩性霉素B脂質(zhì)復(fù)合物（ABLC）及兩性霉素B膠體分散體（AB－CD）。目前，它們可用于難治性真菌感染或?qū)尚悦顾谺不能耐受的真菌感染，也可用于中性粒細(xì)胞減少的發(fā)熱患者的經(jīng)驗(yàn)性治療。

2.3 篩選新作用機(jī)制的抗真菌藥物

將真菌細(xì)胞壁作為一個(gè)的抗真菌藥物作用靶點(diǎn)設(shè)計(jì)合成半合成抗生素，其中較成功的是卡泊芬凈（Caspofungin）等。卡泊芬凈是第一個(gè)由美國食品和藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)用于治療真菌感染的棘球白素類抗真菌藥物。卡泊芬凈對念珠菌、曲霉菌等有良好的抑制活性，對一些雙性真菌如組織胞漿菌、粗球孢子菌、皮炎芽生菌等也有抑制作用。卡泊芬凈已被批準(zhǔn)用于治療念珠菌感染和侵襲性曲霉菌病，尤其是對傳統(tǒng)的抗真菌治療無效或無法耐受的病例，已于2001年由Merck公司開發(fā)上市。除卡泊芬凈外，還有很多種正處于研究開發(fā)中的棘球白素類藥物，如Micafungin，Anidulafungin等，其抗真菌作用及作用機(jī)制與卡泊芬凈相同，目前正進(jìn)行Ⅲ期臨床試驗(yàn)。此外，在抗真菌藥物新作用機(jī)制的研發(fā)方面還有抑制幾丁質(zhì)合成酶的藥物如Nikkomycin Z，作用于甘露聚糖蛋白物質(zhì)的Pradimi－cin與Benaomicin等。

3 展望

抗真菌藥物耐藥性的發(fā)展已引起各國學(xué)者的高度重視，促進(jìn)了抗真菌藥物耐藥性的深入研究。目前的研究一方面是進(jìn)一步探討抗真菌藥物產(chǎn)生耐藥的機(jī)制、傳播方式、耐藥性與臨床治療失敗的關(guān)系，以及建立雙相性真菌和霉菌的藥敏實(shí)驗(yàn)方法，控制耐藥性的發(fā)展；另一方面是加快開發(fā)新型抗真菌藥物，以應(yīng)對日益增多的耐藥真菌。脂質(zhì)型兩性霉素B、新型唑類藥物，以及棘球白素類抗真菌藥物的問世，反映抗真菌藥物研究正向高效、廣譜、低毒的方向發(fā)展，為各種類型真菌感染的治療提供新型的有力的手段。目前，抗真菌新藥的開發(fā)方興未艾，一些高科技手段如計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)技術(shù)的應(yīng)用將更加促進(jìn)其創(chuàng)新性研究，相信不久的將來在抗真菌治療方面一定會不斷取得重大突破。

作者簡介：趙文艷（1968－），女，主任藥師，從事臨床藥學(xué)工作，（電子信箱）xyz3107＠sohu.com。

參考文獻(xiàn)：

[1]張宇平，崔 健.1108株深部真菌醫(yī)院感染耐藥性分析[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2010（8）：1186－1187.

[2]蔡木禹，林朝仙，黃雯雯.卡泊芬凈治療重癥監(jiān)護(hù)患者侵襲性真菌感染對氟康唑無效/不能耐受的療效分析[J].中國藥房，2010（24）：2260－2262.

[3]顧覺奮，魏清筠.真菌耐藥機(jī)制及新藥研究動(dòng)態(tài)[J].藥學(xué)與臨床研究，2010（3）：303－306.

[4]謝 宏，竇 娟，任芒格，等.熱帶假絲酵母菌外排泵基因與氟康唑耐藥性的初步研究[J].中華臨床醫(yī)師雜志，2011（24）：7395－7398.

[5]Wada S，Nii mi M，Nii mi K，et al.Candida glabrata ATP－binding cassette transporters Cdrlp and Pdh1p expressedin aSaccharomyces cerevisiaestrain deficient in membrane transporters show phosporylation－De－pendent pumping properties[J].Journal of Biological Chemistry，2002，277（48）：46809－46821.

[6]Revankar SG，F(xiàn)u J，Rinaldi MG，et al.Cloning and characterization of the lanosterol14α－demethy lase（ERG11）gene in Cryp tococcus neoform an s[J].Biochenical and Biophysical Research Communication，2004，324：719－728.

[7]Kudo M，Ohi M，Aoyama Y，et al.Effects of Y132H and F145L Substitutions on the Activity，Azole Resistance and Spectral Properties of Candida albicans Sterol 14－Demethylase P450 （CYP51）：A Live Example Showing the Selection of Altered P450 through Interaction with Environmental Compounds[J].J Biochem，2005，137：625－632.

[8]Piddock LJ.Clinically relevant chromosomally encoded multidrug resistance efflux pumps in bacteria[J].Clin Microbiol Rev，2006，19（2）：382－402.

[9]Kerr ID.Structure and association of ATP－bingding cassette transporter nucleotide－binding domains[J].Biochim Biophys Acta，2002，1561（1）：47－64.

[10]David SP.Resistance to echinocandin－class antifungal drugs[J].Drug Resistance Update，2007，10：121－130.

[11]Calabrese D，Bille J，Sanglard D.A novel multidrug efflux transporter gene of the major facilitator superfamily from Candida albicans （FLU1）conferring resistance to fl uconazole[J].Microbiology，2000，146（Pt11）：2743－2754.

[12]Nailis H，Vandenbosch D，Deforce D，et al.Transcriptional response to fluconazole and amphotericin B in Candida albicans biofi lms[J].Res Microbiol，2010，161（4）：284－292.

[13]Hsiao CR，Huang L，Bouchara JP，et al.Identification of medically important molds by all oligonucleotide assay[J].J Clin Microbiol，2005，43（8）：3760－3768.

[14]Walsh TJ，Raad I，Patterson TF，et al.Treatment of invasive aspergillosis with posaconazole in patients who are refractory to or intolerant of conventional therapy： an externally controlled trial[J].Clin Infect Dis，2007，44：2－12.

[15]Ullmann AJ，Lipton JH，Vesole DH，et al.Posaconazole or fluconazole for prophylaxis in severe graft－versus－h(huán)ost disease[J].N Engl J Med，2007，356：335－347.

[16]Cornely OA，Maertens J，Winston DJ，et al.Posaconazole vs.fluconazole or itraconazole prophylaxis in patients with neutropenia[J].N Engl J Med，2007，356：348－359.