冠心病生物標記物血清microRNA的研究進展

陳小良 廉姜芳 周建慶

冠心病生物標記物血清microRNA的研究進展

陳小良 廉姜芳 周建慶

microRNA（miRNA）是一類長度約21～24個核苷酸的內源性單鏈非編碼小分子RNA，在基因轉錄后水平發揮細胞生長調控作用。miRNA不僅在細胞分化、生長、凋亡及機體的正常發育中發揮重要作用，還參與包括冠心病、心律失常、心力衰竭等多種心血管疾病的發生、發展過程[1-2]。研究表明miRNA可在血清中穩定存在，與組織標本來源的miRNA相比，血清miRNA具有采樣方便、穩定性好、靈敏度高、可連續監測等優勢，成為近年冠心病早期診斷標記物的研究熱點之一。本文就血清miRNA作為冠心病診斷標記物的研究進展作一綜述。

1 血清miRNA概述

相關研究表明，miRNA可在外周血中穩定存在。血液中存在降解RNA的核酸酶，但血清中的miRNA可耐受核酸酶的消化，保持穩定[3]。miRNA在室溫、反復凍融、煮沸、久置、強酸（pH=1）強堿（pH=13）等條件下，均可保持穩定[4]。

血清miRNA的來源，目前有學者認為來自于壞死或凋亡的細胞，細胞壞死后釋放組織細胞特異性表達的miRNA入血，致特定疾病狀態下特定miRNA表達的明顯改變；另有學者認為是來自于細胞主動釋放，miRNA能進入微泡、核外體、凋亡體等囊泡中或與Argonaute2（Ago2）蛋白、高密度脂蛋白（HDL）等形成miRNA-蛋白質復合物，通過循環轉移到鄰近或遠處的受體細胞進而產生生物效應[5-7]。

血清miRNA保持穩定的機制主要有：（1）形成微泡：分泌到血液中的miRNA被包裹在脂質泡中，形成微泡，從而免受血清中RNA酶的降解，且微泡表面帶有識別靶細胞的特異性受體或配體，可轉運miRNA至靶細胞，發揮調節功能[5]；（2）形成蛋白復合物：血清miRNA以蛋白復合體的形式存在。Arroyo等[6]研究發現，miRNA與Ago2蛋白結合形成Ago2-miRNA蛋白復合體，可保護miRNA不被RNA酶降解。近年來有研究發現，有另兩種miRNA結合蛋白：核磷蛋白（nucleophosmin 1，NPM1）[8]和HDL[7]也可介導部分miRNA從胞內釋放至胞外，并保護miRNA不被RNA酶降解。miRNA在血清中的穩定存在，為血清中miRNA的檢測提供了可能。

2 血清miRNA的檢測方法

目前血清miRNA的檢測方法主要有Northern雜交技術、實時熒光定量PCR、高通量序列分析法、基因芯片法等。Northern雜交技術操作繁瑣、樣本量需求大、靈敏度較低，一般不用于臨床樣本的檢測。實時熒光定量PCR具有較高的靈敏度、特異度和重復性，已成為現階段核酸分子定量檢測的金標準，可精確地定量分析miRNA的表達,是目前基礎及臨床研究中最常采用的血清miRNA檢測方法。根據引物的不同，實時熒光定量PCR可以分為莖環法和加尾法，莖環法特異度較高。高通量序列分析法具有高通量、準確度高的特性，但數據量大、價格較昂貴，一般只用于新miRNA的篩選。基因芯片法又稱微陣列，具有快速、高通量的特性，但存在背景及混雜信號干擾，重復性較差，用于miRNA的初篩，其結果還需采用實時熒光定量PCR等方法加以驗證。

3 血清miRNA用于冠心病診斷的種類與機制

冠心病作為對人類健康威脅最大的疾病之一，對其作出早期準確的診斷，并給予積極有效的干預能夠很好的改善預后。生物標記物的研究在心血管系統疾病中研究最多的就是冠心病，尤其是在急性心肌梗死（AMI）中。雖然心肌肌鈣蛋白（cTn）對心肌壞死具有很高的敏感度及特異度，但對于4h以內的AMI診斷仍具有一定的局限性。尋找更為快速、敏感、特異的心肌標記物成為目前研究的熱點。最近研究發現血清中TNF-α和IL-8的表達水平在心絞痛和心肌梗死中均顯著升高且存在差異性[9]；翁秀妹等[10]也發現血清骨保護素水平在慢性冠心病中顯著升高且與冠狀動脈狹窄的嚴重程度密切相關。血清miRNA也有著作為理想標記物的重要特征：在外周血中穩定存在、獲取簡便、樣本易得、組織及疾病特異性、用實時熒光定量PCR的方法容易測量。目前發現與冠心病相關的血清miRNA很多，其中研究較多的有miR-1、miR-133、miR-499、miR-126和miR-155等。

3.1 miR-1 miR-1主要在心肌和骨骼肌中特異性表達，分為miR-1-1和miR-1-2。miR-1-1主要參與心臟發育和肌肉分化。Cheng等[11]發現通過結扎冠狀動脈左前降支造成AMI的小鼠血清中miR-1水平與對照組相比在心肌梗死后6 h升高了 200倍，心肌梗死3d后miR-1降至正常水平，并且心肌梗死小鼠血清中miR-1水平的升高與其心肌梗死面積呈正相關。同時，他們通過臨床研究還發現AMI患者血清miR-1水平與對照組相比在心肌梗死后6h升高了100倍，且其血清miR-1水平的升高與CK-MB水平的升高呈正相關,結果表明miR-1和CK-MB的表達水平表現出相同的趨勢。這些預示著miR-1有可能為AMI新一代的標記物。

3.2 miR-133 miR-133有miR-133a和miR-133b兩種亞型，與編碼miR-1的基因處于同一條染色體的相鄰位置，也特異性表達于心肌和骨骼肌細胞中，參與多種心血管疾病的發生、發展。

D’Alessandra等[12]的研究發現大鼠冠狀動脈閉塞6h后，梗死區miR-1、miR-133的表達水平均下降；而在血清或血漿中檢測到miR-1、miR-133和miR-499-5p的水平則增高，說明miR-1、miR-133在心肌損傷后才釋放入血，并在心肌梗死患者出現癥狀后156min后即能檢測到miR-1、miR-133高峰值，且此數值比cTn I峰值來得更高、更早。Eitel等[13]對126例ST段抬高型心肌梗死（STEMI）患者進行研究，也發現血清miR-133a水平的升高與心肌損傷修復、損傷面積的擴大和再灌注損傷密切相關。這些結果提示血清miR-133可能是一種有意義的早期診斷AMI的生物標記物，對于早期接受手術治療挽救心肌有至關重要的意義。

3.3 miR-499 miR-499在肌肉中特異表達，在肌球蛋白基因調控中起重要作用。在AMI患者與小鼠AMI模型（冠狀動脈結扎）血清中miR-133a、miR-1和miR-499-5p的水平均升高。從達峰時間上看，在AMI的典型癥狀胸痛已發生而肌酸磷酸激酶（CPK）和cT-nT的水平還未升高時，miR-1和miR-133a的水平已達峰值[12，14]；而miR-499-5p的峰值延遲至胸痛發生后6～I2h[12，15]。Li等[16]研究發現,與健康組相比，有 6個miRNAs（miR-1、miR-134、miR-186、miR-208、miR-223、miR-499）均在AMI患者血清中表達明顯升高，且miR-208、miR-499在心絞痛中表達更高。上述結果均表明，miR-499也有作為生物標記物診斷冠心病的潛力。

3.4 miR-126和miR-155 miR-126是特異性的內皮細胞的miRNA，參與了內皮細胞的生物合成、血管發育等過程。Fichtlscherer等[17]通過基因生物芯片對8例冠心病患者和8例健康志愿者血清和血漿中miRNAs表達譜進行檢測，發現在冠心病患者中miR-126表達水平顯著降低；為了進一步驗證這些結果，他們又利用實時熒光定量PCR（RT-PCR）檢測了31例冠心病患者和14例健康志愿者血清中的miR-126和miRNA-155水平，仍然發現這些miRNAs表達在冠心病患者中是顯著降低的。Matsumoto等[18]調查研究發現，在AMI患者康復出院后1年內發生心臟死亡事件者血清中miR-155和miR-380的表達水平分別比健康者高4倍和3倍，這提示miRNAs不僅可以作為診斷疾病的標記物，還可以評估預后，血清miRNAs也許可以列入60歲以上患者入院常規檢查項目，以篩查不典型AMI，降低病死率。

4 血清miRNA用于診斷冠心病的前景

血清miRNA用于冠心病診斷時具有的優勢為：檢測時損傷小、穩定性好、靈敏度高、檢測方便、快捷等，而其缺點為血清中miRNA的含量較低，一般方法學不易檢測。因此，尋找一種靈敏度高、操作簡單且成本低廉的檢測方法是血清miRNA應用于冠心病臨床檢測前需進一步解決的問題。解決的方法可能有以下幾個方面：（1）選擇合適的內參：內參的穩定性決定了檢測結果的可靠性，以消除樣品間RNA含量的差異。目前用于冠心病血清樣本檢測的內參最常用的有RNU6B和miR-16兩種。（2）選用上調標記物：優先選擇在冠心病中表達上調的血清miRNA，這樣可提高檢測的靈敏度和特異度。（3）多種標記物聯合使用：僅僅采用一種血清miRNA作為冠心病標記物往往特異度不高，若將miRNA與其它類型冠心病標記物檢測相結合，有望顯著提高診斷的準確性。

總之，雖然相關研究尚處于起步階段，然而miRNA最新的研究結果令人驚喜，miRNA具有很強的細胞、組織或疾病特異性，這些特異性表達既是其功能研究的基礎，又是很好的疾病標記物。相信隨著檢測方法的成熟和研究的深入，血清miRNA會在冠心病的預測、診斷、預后評估、個體化治療等方面擁有廣闊的應用前景。

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2013-12-30）

（本文編輯：馬雯娜）

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周建慶，E-mail：hjmpin@163.com