不同貯藏條件下錐栗花粉生活力研究

王碧芳 ，袁德義 ，劉冬明 ，范曉明 ，唐 靜 ，鄒 鋒

(1.中南林業(yè)科技大學(xué)a.林學(xué)院；b.經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410004；2.北京林業(yè)大學(xué) 省部共建森林培育與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083)

錐栗Castanea henryiRehd.et Wils.屬于殼斗科栗屬堅(jiān)果類植物，為我國(guó)重要的木本糧食樹種之一[1-2]。錐栗果實(shí)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高，含有豐富的淀粉、糖、蛋白質(zhì)、脂肪、氨基酸、抗壞血酸及胡蘿卜素，越來(lái)越受到大眾的青睞[3]。錐栗為典型的異花授粉植物，要獲得優(yōu)良的錐栗新品種，主要途徑之一就是人工雜交育種，而保存花粉是雜交育種過(guò)程中的重要環(huán)節(jié)。錐栗雜交育種普遍存在花期不遇和授粉授精不良的問(wèn)題，這會(huì)致使空苞率高而坐果率低[4]。貯藏花粉可以克服雜交育種中異地雜交和花期不遇的困難。目前，對(duì)百合[5]、牡丹[6]、油茶[7]、玉蘭[8]、紅心杉[9]、桉樹[10]的花粉貯藏特性的研究報(bào)道較多，而有關(guān)錐栗花粉貯藏特性的研究報(bào)道則較少。為給錐栗的雜交育種及其花粉資源的保存等方面的研究提供參考，以錐栗花粉為試驗(yàn)材料，對(duì)其花粉的貯藏特性進(jìn)行了試驗(yàn)研究，現(xiàn)將研究結(jié)果分析報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以錐栗‘華栗4號(hào)’的花粉為試材，材料采自湖南省郴州市汝城縣中南林業(yè)科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)基地內(nèi)7年生正常結(jié)果的錐栗優(yōu)良單株。試驗(yàn)地年平均氣溫16.6℃，年平均降水量1 547.1mm，平均日照1 713h，無(wú)霜期273d。試驗(yàn)地的水肥條件良好，管理措施和立地條件完全一致。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 花粉的收集

于2013年5月采集錐栗‘華栗4號(hào)’盛花期的花粉，參照唐靜等人[3]的方法，用牙刷刷下花序上的花藥，置于硫酸紙上放在100 W燈泡下烘烤，把溫度控制在30℃左右，花粉散出后用硫酸紙包成小包以備用。

1.2.2 花粉貯藏條件試驗(yàn)

將收集到的花粉分別采用離心管自然密封和離心管加入干燥劑(硅膠)密封的不同方式進(jìn)行密封處理，再將以不同方式密封的花粉分別貯藏于室溫和4、-20和-80℃這4種溫度環(huán)境中，每隔一定時(shí)間檢測(cè)花粉的萌發(fā)率，檢測(cè)前要作冰上解凍處理[11]。

1.2.3 花粉生活力的測(cè)定

以花粉萌發(fā)率作為花粉生活力的測(cè)定指標(biāo)[12]，運(yùn)用離體萌發(fā)測(cè)定法進(jìn)行測(cè)定。以10％蔗糖＋1％瓊脂＋0.005％硼酸[3]為固體培養(yǎng)基，將花粉撒播于培養(yǎng)基上，置于30℃的恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)30h，然后用Olympus顯微鏡觀察其萌發(fā)情況。每個(gè)處理3次重復(fù)，每次重復(fù)隨機(jī)選取5個(gè)視野，每個(gè)視野觀測(cè)的花粉粒數(shù)不少于50粒。統(tǒng)計(jì)時(shí)以花粉管長(zhǎng)度超過(guò)花粉粒直徑記為萌發(fā)，花粉萌發(fā)率的計(jì)算公式[13]如下。

花粉萌發(fā)率(％)＝(已經(jīng)萌發(fā)的花粉數(shù)/花粉總數(shù))×100。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 室溫貯藏條件下花粉生活力的變化情況

在室溫環(huán)境中不同干燥條件和貯藏時(shí)間下‘華栗4號(hào)’花粉的萌發(fā)率如圖1所示。從圖1中可以看出，同樣是室溫貯藏，因?yàn)闈穸群唾A藏時(shí)間不同，故花粉的生活力有差異，花粉活力變化的總趨勢(shì)為，隨著貯藏天數(shù)的增加，其萌發(fā)率下降，且非干燥貯藏的效果優(yōu)于干燥貯藏的效果。在室溫干燥條件下，‘華栗4號(hào)’花粉貯藏9d后其萌發(fā)率降為27.4％；貯藏15d后，其萌發(fā)率降到了15.7％；貯藏27d后，其萌發(fā)率僅為2.4％。干燥貯藏處理的花粉其萌發(fā)趨勢(shì)與非干燥貯藏處理的相似。在室溫非干燥條件下，‘華栗4號(hào)’花粉貯藏9d，其生活力仍較高，為35.5％；貯藏15d后，其萌發(fā)率仍為25.9％；貯藏27d后，其萌發(fā)率降至6.4％。總體來(lái)看，錐栗‘華栗4號(hào)’花粉在室溫條件下的貯藏期較短，貯藏27d左右其生活力基本喪失。

圖1 室溫條件下不同處理方式對(duì)‘華栗4號(hào)’花粉萌發(fā)率的影響Fig.1 Effect of different treatments on germination rates of ‘Huali No.4’ pollens at room temperature

2.2 4℃貯藏條件下花粉生活力的變化情況

在4℃的溫度環(huán)境中不同干燥條件和貯藏時(shí)間下‘華栗4號(hào)’花粉活力的變化情況如圖2所示。由圖2可知，‘華栗4號(hào)’花粉的萌發(fā)率隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，且非干燥處理的貯藏效果優(yōu)于干燥處理的貯藏效果。在4℃干燥條件下，‘華栗4號(hào)’花粉貯藏20d后其萌發(fā)率降為28.5％；貯藏90d后其萌發(fā)率的下降幅度較大，下降了47.9％；貯藏至120d其萌發(fā)率僅為3.3％。在4℃非干燥條件下，‘華栗4號(hào)’花粉貯藏20d后其萌發(fā)率仍較高，為34.5％；貯藏90d后其萌發(fā)率的下降幅度亦較大，下降了42.8％；貯藏至120d后其萌發(fā)率降至6.3％。與室溫貯藏的相比，在4℃低溫冷藏條件下，‘華栗4號(hào)’花粉的生活力保持較好，貯藏30d后其萌發(fā)率仍然較高，非干燥貯藏處理的花粉其萌發(fā)率為32.6％，而干燥貯藏處理的花粉其萌發(fā)率只有26.9％。

圖2 4℃條件下不同處理方式對(duì)‘華栗4號(hào)’花粉萌發(fā)率的影響Fig.2 Effect of different treatments on germination rates of ‘Huali No.4’ pollens at 4℃

2.3 -20℃貯藏條件下花粉生活力的變化情況

在-20℃的低溫環(huán)境中不同干燥條件和貯藏時(shí)間下‘華栗4號(hào)’花粉的萌發(fā)率如圖3所示。由圖3可知，與4℃貯藏條件的相比，在-20℃的低溫條件下，花粉的萌發(fā)率隨著貯藏時(shí)間的推移而下降的速度明顯減緩，且非干燥處理的貯藏效果優(yōu)于干燥處理的貯藏效果，其具體變化情況如下：干燥貯藏處理和非干燥貯藏處理的花粉其生活力均一直呈下降趨勢(shì)；花粉貯藏30d后，干燥貯藏處理和非干燥貯藏處理的花粉其生活力的下降速度間無(wú)明顯差異；貯藏60d后，干燥貯藏處理的花粉其生活力的下降速度要快于非干燥貯藏處理的；花粉在-20℃下冷凍120d后，干燥貯藏處理和非干燥貯藏處理的花粉其萌發(fā)率分別為21.7％和27.5％，而在4℃低溫下冷藏120d后的花粉幾乎全部喪失了活力；在-20℃低溫下貯藏210d后，干燥貯藏處理與非干燥貯藏處理的花粉其萌發(fā)率均已降到10％以下。

2.4 -80℃貯藏條件下花粉生活力的變化情況

對(duì)在-80℃的低溫環(huán)境中分別貯藏了30、60、90、120、150、180、210、240、270d 的 花粉生活力的測(cè)定結(jié)果如圖4。由圖4可知，‘華栗4號(hào)’花粉萌發(fā)率的下降幅度較小，呈緩慢下降趨勢(shì)，且非干燥貯藏效果優(yōu)于干燥貯藏效果。在-80℃非干燥條件下，花粉貯藏90d時(shí)其萌發(fā)率仍較高，為45.4％；貯藏210d后其萌發(fā)率降為21.6％；貯藏至270d時(shí)其萌發(fā)率降至8.1％。干燥貯藏處理的花粉萌發(fā)趨勢(shì)與非干燥貯藏處理的萌發(fā)趨勢(shì)相似。在-80℃干燥條件下貯藏90d后，花粉萌發(fā)率降為43.8％；貯藏210d后其萌發(fā)率降為17.3％；貯藏至270d時(shí)其萌發(fā)率僅為5.4％，已不宜用于人工授粉。總體來(lái)看，與-20℃的低溫條件相比，在-80℃的低溫冷凍條件下，花粉的生活力保持較好，貯藏210d后其萌發(fā)率仍在17％以上；而在-20℃的低溫下冷凍120d后花粉的生活力基本喪失(如圖4)。

圖3 -20℃條件下不同處理方式對(duì)‘華栗4號(hào)’花粉萌發(fā)率的影響Fig.3 Effect of different treatments on germination rates of ‘Huali No.4’ pollens at - 20℃

圖4 -80℃條件下不同處理方式對(duì)‘華栗4號(hào)’花粉萌發(fā)率的影響Fig.4 Effect of different treatments on germination rates of ‘Huali No.4’ pollens at - 80℃

3 結(jié)論與討論

一般認(rèn)為，貯藏溫度越低花粉壽命越長(zhǎng)。賈文慶等人[14]研究發(fā)現(xiàn)，鳶尾花粉在常溫貯藏20d后其活力基本喪失，而在-196℃干燥條件下其耐貯藏時(shí)間可達(dá)400d以上。紅花酢漿草花粉在室溫貯藏6d后就不再萌發(fā)，而在-80℃的真空干燥環(huán)境下花粉活力可維持28d[15]。本研究結(jié)果表明：在4種貯藏溫度條件下，錐栗‘華栗4號(hào)’花粉生活力均隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而下降，室溫下花粉的生活力下降最快而貯藏時(shí)間最短，-80℃下其生活力下降最慢而貯藏時(shí)間最長(zhǎng)。‘華栗4號(hào)’室溫貯藏27d后花粉活力基本喪失，這可能因?yàn)槭覂?nèi)溫度較高，花粉內(nèi)部呼吸作用增強(qiáng)，營(yíng)養(yǎng)消耗殆盡而亡，同時(shí)室溫下花粉粒又容易脫水死亡。本試驗(yàn)結(jié)果表明，‘華栗4號(hào)’花粉在室溫貯藏6d后其萌發(fā)率仍在34％以上，而鄭誠(chéng)樂(lè)等人[16]認(rèn)為，錐栗‘白露仔’在室溫貯藏6d后其萌發(fā)率為0，這可能與本試驗(yàn)所用的品種及貯藏時(shí)的含水量不同有關(guān)。4℃適于‘華栗4號(hào)’花粉的短期貯藏，貯藏30d時(shí)其萌發(fā)率仍在26％以上；而-20、-80℃的低溫條件適于‘華栗4號(hào)’花粉的長(zhǎng)期貯藏，且-80℃下花粉的耐貯藏能力更好，‘華栗4號(hào)’在-20℃下貯藏90d時(shí)其生活力在26％以上，貯藏210d后其生活力基本喪失，而在-80℃的低溫條件下貯藏210d時(shí)，‘華栗4號(hào)’花粉的生活力在17％以上，貯藏270d后仍有一定的生活力。

花粉的生活力除了與溫度密切相關(guān)外，還受到貯藏環(huán)境的濕度、花粉自身含水量的影響[17]。大多數(shù)植物的花粉最適貯藏濕度都在60％以下，也有研究發(fā)現(xiàn)，有很多物種的花粉在貯藏時(shí)的相對(duì)濕度不能低于40％，否則，花粉的生活力便很快降低[18]。本研究結(jié)果表明：在4種貯藏溫度條件下，非干燥貯藏效果均優(yōu)于干燥貯藏效果，這與呂晉慧等人[11]和王小敏等人[19]的干燥時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、花粉含水量過(guò)低影響花粉活力的觀點(diǎn)一致。

綜上所述，錐栗‘華栗4號(hào)’花粉在-80℃非干燥環(huán)境下貯藏的效果最好，貯藏210d后其生活力達(dá)21.8％，貯藏270d后仍有一定的生活力。至于更低溫度條件(-196℃)液氮貯藏對(duì)錐栗花粉生活力的影響情況尚待今后繼續(xù)研究。

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