microRNA概述及其研究進展

齊 斌 綜述 余麗梅 審校

microRNA概述及其研究進展

齊 斌 綜述 余麗梅 審校

microRNA是一類長約20～22個核苷酸的非編碼小RNA，能夠在轉錄后水平調控基因表達，在細胞衰老、疾病發生發展等多種生命進程中具有重要的調控作用，在抗衰老和多種疾病治療方面具有巨大的應用潛力。近年來，microRNA在組織工程等領域均成為研究熱點。本文對microRNA的生物合成過程、作用機制，及其與衰老相關疾病的關系和臨床應用進展進行綜述。

組織工程小核糖核酸合成過程作用機制細胞衰老臨床應用

組織工程興起于上世紀80年代，其核心是利用細胞與生物材料研究開發具有生物活性的人工替代物，以維持、恢復和提高人體受損組織功能。種子細胞是組織工程的三大核心之一，獲取足量且優質的種子細胞是重建組織器官的基礎，是開展組織工程研究的前提。由最初的各種體細胞，如成纖維細胞、內皮細胞、骨細胞，到現在以各種類型的干細胞作為主要的種子細胞，組織工程取得了快速的發展。microRNA作為重要調節因子，對各種干細胞的增殖、分化、干性維持等都具有重要的調節作用。其對體外培養過程中，維持細胞的增殖能力，以獲取足夠數量種子細胞，維持細胞培養過程中的干性，以及誘導體細胞重編以發現新的種子細胞等方面都具有重要的研究價值。另外，microRNA又可以作為生物標記物，在種子細胞的優選方面發揮重要作用。

1 microRNA的發現及合成過程

1993年，Lee等對秀麗隱桿線蟲的早期發育進行遺傳篩選時，發現了一種不編碼蛋白質的基因：lin-4。lin-4并不編碼蛋白，但能夠產生一對小的RNA。后來，人們認識到lin-4是一類豐富的小的調控RNA的一員，即所謂的microRNA。

microRNA是一類長約21-23個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，作用于靶基因的3'非編碼端，抑制靶模板RNA（mRNA）的翻譯，或使其降解來發揮作用，在干細胞的更新、分化、細胞周期和細胞凋亡等生物學進程中，都發揮重要的調控作用[1]。microRNA成熟之前要經歷一系列的改變，經典的microRNA合成途徑是，首先在細胞核內microRNA表現為較長的RNA聚合酶Ⅱ（polⅡ）的轉錄產物—初級微小RNA（pri-microRNAs），大約50%的microRNA具有自己的啟動子，另一半則存在于編碼或非編碼區的內含子或外顯子中。pri-microRNA由上千個核苷酸組成，并具有發卡狀莖環結構，而microRNA就包含在pri-mRNA的發卡狀莖環結構中，當pri-microRNA合成后，它的發卡狀結構立刻被剪切下來成為pre-microRNA。這個過程是在細胞核中進行的，由核糖核酸酶Ⅲ型蛋白Drosha進行，且需要輔因子DGCR8（Di-George syndrome critical region gene 8）的參與，Drosha與DGCR8共同組成微處理器復合體。下一步，pre-microRNA經Ran-GTP依賴性核漿轉運子、轉運蛋白Exporting-5轉運到細胞質中，并且此過程中其序列和結構的完整性得到保護。在轉運到細胞質中后，轉運復合體去磷酸化，GTP轉變成GDP，從而釋放pre-microRNA，然后由另一種RNaseⅢ—Dicer酶把pre-microRNA剪切為小的雙鏈RNA（dsRNA），雙鏈中的一條為成熟的microRNA，另一條則為它的互補鏈。然后下一步加工過程將用到TRBP（Transactivation response RNA-Bindng domain）。它能夠與dsRNA結合域結合然后富集阿古爾蛋白（Ago2），Ago2是RISC（RNA induced Silencing Complex）的主要組成部分。RISC的作用是選擇性結合兩條鏈中5'端熱力學穩定性最差的那一條，那么這條鏈即為成熟的microRNA，另一條則為互補鏈。互補鏈沒有結合RISC，因此在體內應是趨向于降解的，但是microRNA文庫法檢測不同組織中的microRNA時，仍能檢測到這條互補鏈。Ro等[2]對小鼠和人的969個microRNA進行分析時證實，其中有117個是互補鏈，說明也可能存在雙鏈的microRNA。而且不論是成熟的microRNA，或者它的互補鏈，都具有組織特異性，如miR-30e-3p在胃組織中富集，而它的互補鏈miR-30e-5p則在胰腺組織中含量豐富。

2 microRNA的生物學作用及機制

隨著microRNA表達譜芯片、生物信息學技術等新技術的應用，越來越多的microRNA在動植物甚至病毒中被發現。新版本的miR Base 20.0數據顯示，microRNA發夾前體序列已升至24 521條，成熟microRNA序列升至30 424條。小鼠成熟的microRNA新增至1 908條，大鼠成熟的microRNA新增至728條，人類成熟的microRNA則新增至2 578條。

microRNA在動植物的生命過程中起著重要的調控作用。Palatnik等證實，miR-Jaw控制植物葉和其他細胞分裂。Millar等證明，miR-159在擬南芥中通過調控MYB33和MYB65兩種轉錄基因，調節植物的生殖發育。mir-164通過對靶基因CUP SHAPED COTYLEDON(CUP)1,2等的作用，調控分裂組織的邊界和胚胎、營養器官和花的形成，miR-164過量表達會導致花器官或葉子的融合。Brennecke等在果蠅中發現，microRNA-bantam作用于基因hid，并負性調節細胞的程序性死亡。Giraldez等在dicer突變型斑馬魚的胚胎中注射miR-430，有效地改變了大腦畸形，也可在某種程度上調節神經發育。

在人類衰老相關性疾病中，如心腦血管性疾病、纖維化疾病、神經退行性疾病等，都存在microRNA差異性改變。Hebert等發現，阿茲海默癥患者的大腦組織中miR-29的表達量下調。Persengiev等發現，在人的小腦衰老過程中，miR-144表達量升高。Drummond等發現，在人類骨骼肌細胞衰老過程中Let-7b和Let-7c的表達量升高。microRNA的異常表達也與許多疾病相關，如癌癥、精神分裂癥、腎功能障礙、妥瑞綜合癥、牛皮癬、原發性肌肉疾病、脆性X染色體綜合癥、慢性肝炎、真性紅細胞增多、艾滋病和肥胖等[3]。現已證實，microRNA廣泛存在于真核生物體細胞中，是最大的基因家族之一，大約占整個基因組的1%[4]，每個microRNA都具有上百甚至上千個靶基因，如Calin等[5]證明miR-15a/16-1家族能夠直接或間接調控白細胞中14%的基因。至今人們已發現人類有1/3的基因受到microRNA的調控[6]。

microRNA在細胞的衰老過程中具有重要的調控作用，而細胞衰老是導致組織和機體衰老的重要因素。如Menghini等發現，microRNA-217能夠同時抑制SIRT1和FOXO1的去乙酰化，誘導內皮細胞的衰老。Mudhasani等發現，一些microRNA的缺失能夠導致P53和P19的表達量升高，使胚胎成纖維細胞衰老。Bai等發現，miR-34a和miR-335在腎臟系膜細胞衰老過程中表達上調，導致細胞線粒體中的活性氧自由基升高，引起細胞的衰老。

microRNA也被證實在胚胎干細胞中，對干細胞的自我更新、多向分化有著重要的調控作用。首次發現的調控分化證據來自小鼠和人類胚胎干細胞（Embryonic stem cell，ESC）的研究。microRNA的缺失會導致體外培養的胚胎干細胞增殖和分化能力缺失，而且dicer酶缺失的小鼠也會在發育早期死亡[7]。研究表明，胚胎干細胞中表達特異的microRNA，如Morin等[8]的多項研究證明，在鼠或人的ESC分化過程中存在一系列的microRNA差異表達。干細胞中這些microRNA的表達水平并不是很高，但microRNA在不同細胞狀態動態水平的差異，也間接證明了microRNA對干細胞特性的調節作用。

microRNA調節基因在轉錄后的表達水平，而且對于hESC的自我更新能力、干性的維持[9-10]和分化[8]至關重要。干細胞中的核心轉錄因子，如Oct4、Sox2和Nanog能夠促進胚胎干細胞中特有的基因表達，并抑制分化[11]，而如果將這些核心轉錄子導入鼠或人的成體細胞中，則能夠將成體細胞重編程為細胞表型、功能都與胚胎干細胞類似的誘導多能干細胞（IPSCs）。而一些microRNA已經證明與這些核心的轉錄因子有直接的聯系，如miR-145抑制核心轉錄因子Oct-4、Sox2、kif4的3'UTR端[12]。miR-134、miR-296、和miR-470靶向抑制小鼠Nanog、Oct-4、Sox2的DNA編碼序列[13]。

成熟的microRNA在Ago2等蛋白的引導下，結合到RNA誘導的沉默復合體（RNA-induced silencing coplex，RISC），并由RISC介導，通過microRNAs 5'端第2～7堿基的8個核苷酸序列，即“種子序列”（Seed sequence），與靶向mRNA的3'端非翻譯區（3'untranslate region，3'UTR）結合，對靶基因進行切割或翻譯抑制，從而調控基因的表達。實際上，大多數的生物信息學分析軟件預測microRNA的靶基因時，都是遵循這個種子序列配對的原則。大量研究也表明，遵循該種子序列配對方法預測的靶基因大部分是正確的，也就有了“種子規律”[14]這一經典的預測microRNA干預靶基因的理論方法。但是，也有些microRNA不遵循此規律，而仍然起到基因沉默的作用[15]。近期的研究表明，microRNA除了作用于mRNA的3'UTR的經典沉默機制，還可以作用于5'UTR[16]、啟動子區[17]，甚至是mRNA的編碼區[13]。而且，microRNA對靶基因的選擇并不要求種子序列完全配對。因此，一個microRNA可能同時抑制上百個不同的信使RNA[18]。所以，microRNA的作用也可視為它對多個靶點抑制的協同作用結果。

3 microRNA的臨床應用

2008年，Lawire等[19]在血液中發現了循環的microRNA，他證明mir-21和mir-155的含量增加與否，能夠鑒別B細胞淋巴瘤患者與健康人，在microRNA研究領域開拓了一條新的研究方向。隨后大量研究在血液、尿液、唾液和其他體液中發現了與許多疾病相關的microRNA。2010年，Weber等[20]在健康成人的12種體液中提取了上百種microRNA。他們檢測了血漿、唾液、眼淚、尿液、羊水、乳汁、支氣管分泌物、腦脊液、腹水、精液中microRNA的表達量，不同體液中檢測到的microRNA數量從200到450個不等。而且證明了不同的體液中，部分microRNA的表達是特異性的，如mir-577在腦脊液中特異表達。而且不同于信使RNA，循環系統中的microRNA穩定性非常好，即使反復凍融或者在長時間的室溫下仍可保持穩定[21]。且循環系統中的microRNA還有個重要的特性，它們是游離態的，不論是囊泡中的microRNA還是與蛋白結合的microRNA[22-23]。microRNA的這些特性都表明，microRNA有希望成為疾病診斷的重要依據。如Chen等[24]對10個血清microRNA組合進行研究，在他的研究中有200例非小細胞型肺癌和110例對照組，檢測的靈敏度和特異性分別能夠達到92.5%和90%。且在回顧性研究中，這10個microRNA組合的檢測也能夠達到7個患者中成功預測6個患者的非小細胞肺癌，并且比現在的檢測方法提早33個月。在相似的研究中，Boeri等[25]以吸煙人群血漿中的15個microRNA作為檢測對象來預測早期肺癌，敏感性達到75%，特異性達到100%。Fu等[26]檢測了肺結核病人血清中的microRNA變化，有59個下調，33個上調，其中miR-29a具有最好的預測價值，感染患者中表達上升了11倍。通過mir-29a檢測結核患者，敏感性達83%，特異性達到80%。Henegan等[27]通過檢測患者血清中miR-195來診斷乳腺癌，敏感性87.7%，特異性91%。miR-195能夠在乳腺癌早期就被檢測到，這時腫瘤直徑還小于2 cm。尤為重要的是，mir-195與腫瘤的大小具有明顯的相關性。當患者實施乳腺癌切除術后，mir-195的水平恢復正常，表明miR-195也能夠作為術后隨診的一項重要指標。Li等[28]發現，血液中的microRNA可作為鑒別不同原因肝損傷的工具，敏感性和特異性均超過96.9%。如檢測miR-375、miR-10a、和miR-223可用來鑒別乙型肝炎患者和健康人，敏感性99.3%，特異性98.8%。

4 展望

隨著越來越多的microRNA被發現，其生理功能和調控機制也越來越清楚。胚胎干細胞和成體干細胞作為組織工程重要的種子細胞，microRNA對各種生物學行為及功能的調節作用將使microRNA在干細胞的組織工程應用中發揮重要作用，可通過查閱人類microRNA疾病數據庫（http:// 202.38.126.151/hmdd/miRNA/md/），來查找與特定疾病相關的microRNA。microRNA調節異常和人類衰老相關性疾病等具有相關性，可通過干預單個或多個microRNA，觀察microRNA對細胞衰老和個體衰老或相關疾病的影響，發掘microRNA在抗衰老或疾病治療方面的潛力。同時，作為一種生物標記物，也將在種子細胞優選和疾病的診斷、預防方面發揮潛力。

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Overview and Research Progress of microRNA

QI Bin,YU Limei.
Zunyi Medical college,Zunyi 563000,China.

【Summary】The microRNA is only 20-22 nucleotides in length and can work as post-DNA transcription regulator for gene expression.It has an important regulating role in the life process such as cell aging,disease and so on.So microRNA has a huge potential for anti-aging and disease treatment.Nowadays it has become one of the most intense interests to the tissue engineering and other area of medicine.In this paper,the biogenesis,mechanism,relationship with cell aging and ageassociated diseases and the clinical application of microRNA were reviewed.

Tissue engineering;microRNA;Biogenesis;Mechanism;Cell ageing;Clinical application

Q522

B

1673－0364（2014）06－03－03

2014年5月11日；

2014年6月30日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2014.06.016

563000貴州省遵義市遵義醫學院。