代謝組學法評價紫蘇子抗小鼠急性肝損傷的作用

耿 芹，鄭床木，管 政,3,*，張小紅，朱 超，楊曙明，陳愛亮,*

代謝組學法評價紫蘇子抗小鼠急性肝損傷的作用

耿 芹1，鄭床木2，管 政2,3,*，張小紅2，朱 超2，楊曙明2，陳愛亮2,*

（1.華爍科技股份有限公司，湖北 武漢 430074；2.中國農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所，北京 100081；3.浙江中醫藥大學藥物研究所，浙江 杭州 310053）

用代謝組學法對紫蘇子抗小鼠急性肝損傷作用進行評價。研究構建四氯化碳（CCl4）致小鼠急性肝損傷模型，采用流動注射-三重四極桿-飛行時間質譜聯用系統對模型組、紫蘇子給藥組、陽性藥聯苯雙酯給藥組及正常對照組動物的肝組織及全血代謝輪廓譜進行比較。采用主成分分析法對各組數據進行分析并初步篩選潛在生物標志物。代謝組學分析、血生化指標檢測及病理研究表明，20 g/kg生藥當量的紫蘇子醇提物對CCl4致小鼠急性肝損傷模型具有與聯苯雙酯臨床等效劑量相似的保肝作用。結果表明，檸檬酸、磷脂酸、溶血磷脂酰膽堿、溶血磷脂酰乙醇胺等9 個代謝物為CCl4致小鼠急性肝損傷及紫蘇子保肝作用的潛在生物標志物；作用途徑與脂質過氧化、能量代謝等有關。

紫蘇子；流動注射；質譜；急性肝損傷；代謝組學；主成分分析

紫蘇子為唇形科植物紫蘇（Perilla frutescens（L.）Britt.）的干燥成熟果實。常用于痰壅氣逆，咳嗽氣喘，腸燥便秘的治療[1]。作為一種在東南亞、北美等地區廣泛種植使用的藥食兩用作物[2]，紫蘇具有巨大的經濟價值與開發潛力。現代藥理研究表明，紫蘇子除具有以上功效外，其酚性成分還具有強抗氧化、抗脂質過氧化、抗炎作用及基于此對肝損傷的保護作用[3-5]。

代謝組學（metabonomics/metabolomics）是繼基因組學和蛋白質組學之后發展起來的一門通過對某一生物或細胞中特定生理時期內所有低分子量代謝物的集合進行定性、定量分析，并尋找代謝物與生理病理變化相對關系的學科，是系統生物學的重要組成部分[6-7]。近年來，在國內先驅者將代謝組學引入中醫藥領域之后，中醫藥代謝組學研究得到了蓬勃的發展，為中藥整體藥效學評價和中醫藥作用機制及其理論研究提供了強有力的現代化研究手段[8-10]。同時，隨著食品組學概念[11-12]的提出及其在西方各國的悄然興起，采用代謝組學法對具有藥食兩用價值的經濟作物展開研究已成為我國農產品進一步占據功能食品國際市場的需要。

流動注射-質譜聯用技術作為一種具有高通量分析能力的方法，雖然會帶來一定的基質效應等問題，但隨著化學計量學及質譜分析技術的發展，近年來的方法學比較研究表明流動注射-電噴霧質譜指紋譜在分析中的應用具有和液質聯用[13-15]、氣質聯用[16-20]以及核磁共振指紋圖譜技術[21-22]相當的信息量和分析價值。這進一步使得該種具有快速分析能力的技術在需要大樣本、大數據量采集分析的代謝組學、臨床檢測及相關藥效、毒理及機制研究中有了發揮的空間[23-24]。

據此，本實驗采用了基于流動注射-三重四極桿-飛行時間質譜聯用技術結合主成分分析（principal component analysis，PCA）的代謝組學法與傳統藥理病理學指標比對，對紫蘇子抗四氯化碳（CCl4）致小鼠急性肝損傷作用進行分析，尋找與紫蘇子保肝作用密切相關的潛在生物標志物，以探討其藥效及可能的作用機制，為進一步利用代謝組學進行相關藥效學研究及紫蘇子作為功能食品的保健價值提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

SPF級昆明小鼠，雄性，體質量（35±3）g，購自北京大學醫學部實驗動物科學部，許可證號：SCXK（京）2011-0012。

紫蘇子（標本號：20111017-LB），購自河北安國冷背藥材有限公司，經陳愛亮副研究 員鑒定。

谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）測試盒、谷草轉氨酶（aspartate transaminase，AST）測試盒南京建成生物工程研究所；聯苯雙酯滴丸 北京協和藥廠；甲醇、甲酸（色譜純） 美國Fisher 公司；Milli-Q超純水 美國Millipore公司。

1.2 儀器與設備

Agilent Technologies 1200 Series高效液相色譜儀美國Agilent公司；AB MDS SCIEX QSTAR?Elite質譜儀美國AB SCIEX公司；BX-61萬能顯微鏡 日本Olympus公司；Infinite F200多功能酶標儀 瑞士Tecan公司；AL104電子天平 瑞士Mettler Toledo公司；全能臺式高速冷凍離心機 美國Thermo Scientific公司；LYOVAC GT2型冷凍干燥機 德國SRK公司。

1.3 方法

1.3.1 紫蘇子醇提物制備方法

取紫蘇子藥材1 kg，加3 倍量80%甲醇冷浸提取3 次，每次24 h，合并提取液，減壓回收，得浸膏，冷凍干燥，得粉末。

1.3.2 模型建立

小鼠常規飼養3 d適應環境后隨機分為正常對照組、CCl4急性肝損傷模型組、病理模型紫蘇子醇提物給藥組及病理模型聯苯雙酯給藥組，每組8 只。除正常對照組外，其他每組小鼠按20 mL/kg體質量腹腔注射0.1%（V/V）的CCl4花生油造模[25-26]；造模同時灌胃給藥，紫蘇子醇提物給藥劑量按生藥材計為20 g/（kg·d）；聯苯雙酯組每天給藥3.5 mg/（kg·d）；正常對照組及模型組則灌胃等容量的生理鹽水。造模后，連續給藥治療3 d，于第3天給藥后3 h采集樣本。

1.3.3 急性肝損傷藥效學實驗

各組動物于末次給藥3 h摘眼球取血。部分血液樣本4 ℃靜置過夜，3 000 r/min離心10 min取血清，供ALT、AST檢測用（樣本處理及檢測方法按說明書操作）。取部分肝臟置于37 g/100 mL的中性甲醛溶液（福爾馬林）中，石蠟包埋、切片，常規蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，光學顯微鏡觀察。

1.3.4 質譜樣品采集與預處理

肝組織樣品0.5 g，按1∶2（m/V）加入生理鹽水做組織勻漿。組織勻漿液及血液樣本（0.8 mL）分別按1∶1（V/V）加入0.1 mol/L的HCl溶液中使藥物蛋白質解離，12 000 r/min離心5 min，繼續加入3 倍量甲醇沉淀蛋白質，12 000 r/min離心10 min。吸取上清，37 ℃氮吹至干。加入1 mL 5%甲醇（含0.1%（V/V）甲酸）渦旋復溶，過Waters公司Oasis系列HLB小柱，自然流速上樣、洗脫，洗脫液為80%甲醇（含0.1%甲酸，過0.22 μm濾膜）。

1.3.5 色譜條件

兩通連接，流動相甲醇，流速0.3 mL/min，進樣量10 μL，數據采集時間1 min，流動注射、直接進樣供質譜數據采集及PCA。

1.3.6 質譜條件

電噴霧離子化源（ESI），正負離子同時檢測。掃描方式為全掃描，飛行時間質譜離子掃描范圍m/z 100～1 000。噴霧電壓4.2 kV，去簇電壓60 V，去簇電壓2為10 V，調焦電壓265 V。碰撞氣及霧化氣均為氮氣，碰撞能35 V。其余參數：霧化氣60 psi；輔助氣50 psi；氣簾氣20 psi；碰撞氣5 psi；溫度500 ℃。兩通連接、流動注射直接進樣。

1.4 數據處理

藥理實驗數據以x±s值表示，做獨立樣本t檢驗進行組間差異比較。質譜數據通過Analyst QS 2.0軟件采集、m/z識別，離子峰相對信號強度進行內標校正，將穩定出現的、質譜豐度0.5%以上的離子數據導入至Excel軟件，手動對齊各組數據。將各組數據分別與模型組數據做獨立樣本t檢驗進行組間差異比較，剔除沒有統計學意義的變量（P＞0.05）后，得到有意義的變量值76 個（血液及肝組織樣本共有），導入統計學軟件IBM SPSS Statistics 19的因子分析項中做PCA。

2 結果與分析

2.1 急性肝損傷藥效學實驗

圖1 小鼠肝臟組織病理形態改變（HE染色）Fig.1 Histopathological changes in livers of mice (HE staining)

如圖1所示，組織病理學檢查結果表明，正常對照組肝小葉結構清晰，無肝細胞壞死；CCl4急性肝損傷模型組的肝臟正常結構被破壞，肝小葉排列紊亂，可見肝細胞變性及大面積灶狀壞死；紫蘇子醇提物給藥組及聯苯雙酯給藥組的肝細胞索排列較整齊，胞漿染色與正常對照組接近，脂肪空泡減少，嗜伊紅染顆粒及肝細胞灶狀壞死面積減少。

如表1所示，生化指標測定結果表明，紫蘇子醇提物對CCl4所致急性肝損傷小鼠血清轉氨酶升高有明顯降低作用。在本實驗設定給藥劑量下，其對血清轉氨酶的降低作用與聯苯雙酯臨床等效劑量相似，與模型組相比有極顯著差異。

表1 紫蘇子醇提物對CCl 急性肝損傷小鼠肝生化指標的影響 x±s, , n＝8）Table 1 Effects of perilla seed extract on hepatic biochemical parameters in mice ( x±s, , n＝8)

2.2 小鼠代謝指紋質譜

小鼠代謝指紋質譜全掃描情況見圖2。得到有意義的變量值76 個（為血液及肝組織樣本共有，圖2只給出血液樣本指紋質譜圖）做PCA。

圖2 小鼠血樣代謝指紋質譜圖（負離子模式）Fig.2 MS metabolic fingerprinting of mouse blood samples (negative ion mode)

2.3 全血及肝臟樣本質譜數據代謝組學分析

圖3 小鼠血液及肝臟樣品質譜數據得分圖（負離子模式）Fig.3 PCA score plot based on the MS metabolic profiling of mouse blood and liver samples (negative ion mode)

如圖3所示，將質譜數據做PCA，正常對照組、模型組、紫蘇子醇提物給藥組、聯苯雙酯給藥組血液及肝臟組織的樣本點均得到了較好分離，結果與病理切片及生化指標可相互佐證，說明小鼠灌胃給藥后機體生理及物質代謝情況已經發生明顯改變，可對各組樣品進行區分。

2.4 潛在生物標志物鑒別

圖4 小鼠血液及肝臟樣品質 譜數據共有變量PCA載荷圖Fig.4 PCA loading plot for IT-MS fingerprints of blood and liver samples of mice

PCA載荷圖能體現變量對于主成分貢獻的大小，在某一主成分方向上距原點越遠的變量對此主成分的貢獻越大。離質心越遠的數據點，即“離群”數據點則常可作為相應分析的標志性變量。選取PCA載荷圖（圖4）中既“離群”又離原點較遠的數據點作為可能的生物標志物進行分析。潛在生物標志物鑒別，則依據各離子的一級及二級質譜的精確質荷比值，到METLIN、KEGG、HMDB、MASSBANK、CHEMSPIDER、METFRAG數據庫中進行檢索，推斷可能的結構及潛在生物標志物。鑒定結果見表2，組間變化情況見圖5。

表2 潛在生物標志物鑒定Table 2 Identification of potential biomarkers

圖5 與小鼠急性肝損傷相關的潛在生物標志物及其相對含量變化趨勢Fig.5 Variations in potential biomarkers associated with acute liver injury syndromes

3 討 論

CCl4對動物體的毒性作用，主要由具有強氧化性的三氯甲基自由基引起。經過肝臟代謝后，它所生成的自由基會與微粒體脂肪及其他的細胞巨分子結合，造成細胞膜結構、線粒體、內質網、細胞能量傳送系統、蛋白合成途徑及核脂質、核蛋白、DNA等的破壞[27-28]。在本實驗中，動物經CCl4處理后，肝組織及血液樣本中檸檬酸含量上升，給予紫蘇子醇提物后含量回落，接近正常對照組，表明紫蘇子醇提物可通過改善三羧酸循環的代謝情況而對CCl4引起的肝臟線粒體功能紊亂有改善作用。該成分的變化趨 勢與黃欣等[29]的報道一致，而與彭思遠等[30]的研究情況相反，認為可能是由于CCl4與全氟辛酸造成肝損傷的作用機制不同引起。同時，在本研究中磷脂酸、溶血磷脂酰膽堿、溶血磷脂酰乙醇胺及肉毒堿在給予CCl4后上調，給予紫蘇子醇提物后下調的系列變化，總體變化趨勢與有關報道一致，體現了紫蘇子醇提物對脂質代謝及細胞膜系統的良好作用[31]。其中，磷脂酸（13∶0/0∶0）及溶血磷脂酰乙醇胺（16∶0）未見報道，可能為新的潛在的急性肝損傷生物標志物。此外，由于CCl4引起的細胞核等的破壞，肌苷及甲基化核苷也呈現了上升趨勢，此趨勢與彭思遠等[30]的研究結果相同。同時，給藥聯苯雙酯及紫蘇子醇提物則可回調肌苷及甲基化核苷的相對含量。在本研究中，牛磺膽酸類物質的變化情況則與徐英等[32]報道的趨勢相同，肝損傷情況下該類物質含量上升，給予治療藥物則下調，表明CCl4所致小鼠急性肝損傷及其相關藥物的治療效果亦可通過影響膽汁酸代謝網絡起作用。

本研究發現主要含有迷迭香酸、迷迭香酸苷及黃酮類物質的紫蘇子醇提物，對CCl4致小鼠急性肝損傷有較好的保護作用，其作用強度在生藥當量20 g/kg時，作用效果與聯苯雙酯臨床等效劑量相當。ALT、AST、病理切片及代謝組學分析結果均表明了紫蘇子醇提物的藥效，實驗結果可相互佐證。

這種基于流動注射進樣的飛行時間質譜數據分析的代謝組學研究方法[33]，相較傳統藥效學評價方法，在數據挖掘、病理機制及藥物作用機制分析方面十分有優勢。較之傳統的高效液相色譜柱分離之后再做質譜檢測分析的方法，則具有檢測速度快（1 min每個樣品）、受外在因素干擾小的優點。盡管單純質譜分離能得到的化合物信息較色譜柱分離后再做質譜檢測會有所減少是它的一個劣勢，但這種旨在和動物藥效研究及臨床檢測方法接軌的探索所得到的潛在生物標志物將可直接應用于后者的分析，方便對大批量數據同時進行檢測與數據挖掘。這對于作為藥效學研究需要足夠樣本量的實驗以及臨床診斷快速檢測來說，很有幫助。同時，也相信隨著多種檢測技術的整合、組學技術及化學計量學研究的發展，這種基于質譜快速分析的方法將 會為藥效學研究及臨床快速診斷帶來幫助，并成為建立客觀、量化的中藥整體藥效作用評價體系的重要組成部分。

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Protective Effect of Perilla Seed on Acute Hepatic Injury in Mice as Evaluated by Metabolomic Analysis

GENG Qin1, ZHENG Chuang-mu2, GUAN Zheng2,3,*, ZHANG Xiao-hong2, ZHU Chao2, YANG Shu-ming2, CHEN Ai-liang2,*
(1. Haiso Technology Co. Ltd., Wuhan 430074, China; 2. Institute of Quality Standards and Testing Technology for Agro-products, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China; 3. Institute of Materia Medica, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China)

The objective of this study was to evaluate the protective effect of perilla (Perilla frutescens) seed on acute hepatic injury induced by carbon tetrachloride. Identification of potential biomarkers was performed by high-performance liquid chromatography (HPLC) and flow injection electrospray ionization with time-of-flight (TOF) mass spectrometry (FIMS) combined with principal component analysis (PCA). Blood and hepatic tissue metabolic profiles were acquired and correlated with the biochemical and histopathological results. In this work, metabolomic profiling, and biochemical and histopathological studies together confirmed th e liver protective effect of perilla seed. Perilla seed at a dose equivalent to 20 g/kg per day caused a similar effect to that of bifendate (3.5 mg/kg per day). Compared with normal control group, the expression of LysoPC, LysoPE, PA, carnitine, citric acid, inosine, methylated nucleoside, and taurohyocholate were increased significantly in model group, whereas the opposite results were observed for the animals which had given perilla seed extract. These findings indicated that the developed metabonomic method based on FIMS might be used as a potentially powerful tool for fast and comprehensive estimation of the liver protective effect of perilla seeds.

perilla seed; flow injection; mass spectrometry; acute hepatic injury; metabonomics; principal component analysis

TS255.1

A

1002-6630（2014）17-0260-06

10.7506/spkx1002-6630-201417050

2013-10-30

耿芹（1980—），女，本科，研究方向為分析化學。E-mail：yujia0715@sohu.com

*通信作者：管政（1980—），女，碩士，研究方向為中藥學。E-mail：zhengguancn@163.com

陳愛亮（1975—），男，副研究員，博士，研究方向為食品科學。E-mail：ailiang.chen@gmail.com