保加利亞乳桿菌對絞股藍皂苷Gypenoside XLⅥ的微生物轉化

劉慧敏，高雅軍，曾 鳴，樸香蘭,*

保加利亞乳桿菌對絞股藍皂苷Gypenoside XLⅥ的微生物轉化

劉慧敏1，高雅軍2，曾 鳴1，樸香蘭1,*

（1.中央民族大學 中國少數民族傳統醫學研究院，北京 100081；2.北京海淀婦幼保健院乳腺病防治中心，北京 100080）

目的：分析絞股藍皂苷Gypenoside ⅩLⅥ的微生物轉化產物。方法：利用益生菌德氏乳桿菌保加利亞亞種的脫脂牛奶培養基對Gypenoside ⅩLⅥ進行微生物轉化，并利用液相色譜離子阱飛行時間串聯質譜方法鑒定Gypenoside ⅩLⅥ的微生物轉化產物。結果：Gypenoside ⅩLⅥ的微生物轉化產物為絞股藍皂苷Gypenoside L、Gypenoside LI、Damulin B 和Damulin A。結論：通過微生物轉化方法可以獲得更多天然產物活性成分。

微生物轉化；絞股藍；gypenoside ⅩLⅥ；德氏乳桿菌保加利亞亞種

生物轉化（biotransformation）是替代天然產物結構修飾的一種方法。它具有很高的區域選擇性、立體選擇性和基團選擇性，可以完成一些化學方法難以進行的反應[1-3]。保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）是產乳酸的細菌，常用于制作酸奶、發酵食品、飲料和飼料。此外，某些保加利亞乳桿菌與其他一些菌種被認為是促進健康的，使乳蛋白產生具有生物活性的有利的肽類成分而被廣泛銷售。保加利亞乳桿菌非常適合于大規模的生產。此菌種適應不同的培養環境，對熱、冷和酸性條件均表現出高耐受性。

絞股藍（Gynostemma pentaphyllum），屬于葫蘆科絞股藍屬多年生草質藤本植物，在亞洲被用來作為民間醫藥，多分布于亞熱帶和北亞熱帶地區。我國絞股藍資源極為豐富，在陜西、湖北、浙江、江蘇、山東等省有栽培。它含有皂苷類[4]、黃酮類[5]、多糖類[6]、維生素、氨基酸[7]等成分，因含有大量的達瑪烷型皂苷[8]，絞股藍在中國被稱為“南方人參”。現代藥理學研究表明其具有增強免疫力、抗高血脂、降血糖、調節肝功能和抑制腫瘤等作用[5,8-11]。在前期的研究中發現，絞股藍中的絞股藍皂苷Gypenoside L、Gypenoside LI、Damulin A和Damulin B對非小細胞肺癌（non-small cell lung carcinoma，NSCLC）A549細胞具有較強的抑制作用[12]，但其含量甚微。

本研究利用絞股藍中的主成分絞股藍皂苷Gypenoside ⅩLⅥ作為底物，通過德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）發酵方法獲得轉化產物，運用液相色譜離子阱飛行時間串聯質譜（liquid chromatography ion trap/time of flight mass，LCMS-IT-TOF）鑒定其轉化產物。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

絞股藍（Gynostemma pentaphyllum） 同仁堂藥店（北京），并設樣品號（GP2011-01）；絞股藍皂苷Gypenoside L、Gypenoside LI、Damulin A、Damulin B及Gypenoside ⅩLⅥ 本實驗室前期分離得到；德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus） 中國工業微生物菌種保藏中心提供，其CICC編號為6047；食用脫脂奶粉 黑龍江省完達山乳業有限公司。

乙腈（色譜純） 美國Grace公司；NW Ultra-pure Water System超純水 Heal Force公司；其余化學試劑均為分析純，購自北京化工廠。

1.2 儀器與設備

液相色譜離子阱飛行時間串聯質譜儀（配有LC-20AD泵、SPD-M20A紫外檢測器、CBM-20A控制器、SIL-20A自動進樣器、CTO-10AS vp控溫箱及LC solution軟件） 日本Shimadzu公司；LDZM-60KCS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠；ZHWY-211C培養振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司；分析柱Shim-pack VP-ODS（150 mm × 2.0 mm，5 μm）日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 絞股藍皂苷Gypenoside ⅩLⅥ的分離、鑒定

絞股藍葉（10 kg）用80%乙醇提取3 次，每次3 h。乙醇提取物用石油醚、二氯甲烷、水飽和正丁醇進行萃取。利用硅膠柱色譜方法，以二氯甲烷-甲醇作為洗脫液（10∶1～1∶1），對正丁醇萃取物進行分離，得到10 個組分。利用Shim-pack PREP-ODS（H）.KIT半制備柱（250 mm × 20 mm，5 μm），以乙腈-水（40∶60，V/V）為洗脫液，以10 mL/min流速對組分5進行分離，得到Gypenoside ⅩLⅥ（150 mg）。其結構通過紫外（ultraviolet，UV）、質譜（mass spectrometry，MS）及核磁共振譜（nuclear magnetic resonance，NMR）等波譜數據與文獻對比，被鑒定為絞股藍皂苷Gypenoside ⅩLⅥ[13]，純度大于98%。

1.3.2 菌種的活化與生物轉化

生物轉化實驗是在脫脂牛奶培養基中進行。培養基配制方法如下：脫脂奶粉（120 g）用水稀釋至1 L，使用前培養基在113 ℃滅菌20 min。

絞股藍皂苷Gypenoside ⅩLⅥ的生物轉化如下：德氏乳桿菌保加利亞亞種接種于含5 mL脫脂牛奶培養基的15 mL試管中，于43 ℃孵育1 d。取500 μL的上述乳桿菌培養基于含有100 mL脫脂牛奶培養基的250 mL的三角燒瓶中，43 ℃孵育1～2 d。加入1 mg/mL的GypenosideⅩLⅥ水溶液2 mL。持續發酵6 d后，收集培養液。

培養液用等體積的水飽和正丁醇進行萃取，共萃取3 次。所得有機溶劑在45 ℃減壓濃縮得到殘留物。殘留物中加入2 mL的甲醇，用0.22 μm的濾膜過濾至進樣瓶中，加蓋保存在4 ℃冰箱中，待測LCMS-IT-TOF。

1.3.3 液相色譜離子阱飛行時間串聯質譜分析

色譜條件：色譜柱：Shimadzu Shim-pack VP-ODS column（150 mm × 2.0 mm，5 μm）；流動相為水（A）-乙腈（B）（0～30 min，30%～70% B）；流速：0.2 mL/min；柱溫：25 ℃；進樣量：10 μL。

質譜條件：離子源：ESI負離子掃描；掃描范圍：m/z 200～1 500；加熱模塊溫度：200℃；CDL溫度：200 ℃；霧化氣流速：1.5 L/min；干燥氣體壓力：103.0 kPa；IT真空度：1.8e-2Pa，TOF真空度：1.9e-4Pa，離子源電壓：負離子模式-3.5 kV；檢測器電壓：1.57 kV。在負離子m/z 961～962、799～800和781～782的多離子色譜（multi ion chromatography，MIC）中進行分析。

2 結果與分析

2.1 液相色譜離子阱飛行時間串聯質譜分析

圖1 德氏乳桿菌保加利亞亞種（A）與絞股藍皂苷Gypenoside ⅩLⅥ（1）發酵前（B）后（C）的正丁醇萃取物的多離子色譜Fig.1 Multi-ion chromatogram of butanol extracts of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus cells (A) and gypenoside ⅩLⅥL before (B) and after (C) microbial transformation by LC-MS

在牛奶培養基中利用ⅩLⅥ德氏乳桿菌保加利亞亞種進行Gypenoside的微生物轉化，用正丁醇萃取其微生物轉化的發酵液，可除去蛋白質等部分雜質。但由于其他雜質的干擾，本實驗選用負離子m/z 961～962、799～800、781～782的MIC進行分析。圖1顯示絞股藍通過德氏乳桿菌保加利亞亞種的發酵前后的正丁醇萃取物的多離子色譜。出現在9.2 min的絞股藍皂苷GypenosideⅩLⅥ經微生物轉化后在15.7、16.2、20.6、21.2 min的保留時間處出現新峰2、3、4、5。結果表明，絞股藍皂苷Gypenoside ⅩLⅥ可被德氏乳桿菌保加利亞亞種生物轉化。

2.2 生物轉化產物的結構鑒定

圖2 絞股藍皂苷Gypenoside ⅩLⅥ被德氏乳桿菌保加利亞亞種生物轉化產物的質譜Fig.2 Mass spectra of microbial transformation products from gypenoside ⅩLⅥL

由圖2可知，在負離子模式ESI-MS中，峰1顯示m/z 961.5392[M-H]-（圖2A），峰2顯示m/z 799.4852 [M-H]-（圖2B），峰3顯示m/z 799.4848[M-H]-（圖2C），峰4顯示m/z 781.4729 [M-H]-（圖2D），峰5顯示m/z 781.4742 [M-H]-（圖2E），通過從絞股藍熱處理產物中分離得到的對照品Gypenoside L、Gypenoside LI、Damulin B、Damulin A[12]比對，4 個生物轉化產物被鑒定為Gypenoside L、Gypenoside LI、Damulin B和Damulin A。

3 結 論

皂苷類化合物是以C30骨架作為母核的糖苷，廣泛存在于植物界中。根據碳骨架不同可分為三萜皂苷和甾體皂苷[14]。其中，三萜皂苷主要存在于五加科、豆科、遠志科和葫蘆科，甾體皂苷主要存在于薯蕷科、百合科和玄參科。此外，海星、海參等海洋生物中也存在皂苷類化合物。皂苷類成分具有復雜的物理化學性質（如具有發泡和乳化作用），因而也具有廣泛的藥理活性，如抗腫瘤、抗炎、抗微生物、抗糖尿病、抗氧化、免疫促進以及心血管和神經保護等作用[15-20]。前期研究表明，熱處理絞股藍產物中分離得到的絞股藍皂苷Gypenoside L、Gypenoside LI、Damulin A和Damulin B具有較強的抑制非小細胞肺癌增殖作用[12]。但這4 個化合物在絞股藍原植物中含量甚微。如何提高植物中有效成分的含量是本實驗的主要目的。

利用微生物對有機化合物進行生物轉化是獲得化學合成方法難以得到的新類型結構的有效方法之一，微生物對三萜類化合物的區域選擇性和立體選擇性轉化已被廣泛研究[21-22]。因為微生物的代謝產物和哺乳動物的代謝物的相似性，最近，微生物轉換可用于預測哺乳動物中的代謝途徑。已報道[23]微生物可成功地用于預測哺乳動物的藥物代謝物的體外模型。

在本研究中，通過乳桿菌保加利亞亞種的牛奶培養基對絞股藍皂苷Gypenoside ⅩLⅥ進行發酵，使其轉化成C20位脫糖基的絞股藍皂苷Gypenoside L、Gypenoside LI和進一步C20（21）、C20（22）脫水的Damulin B和Damulin A。因此，微生物轉化是從天然產物中獲得有效成分的方法之一，通過微生物轉化方法可以獲得更多的有效成分。

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Microbial Transformation of Gypenoside ⅩLⅥ by Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus

LIU Hui-min1, GAO Ya-jun2, ZENG Ming1, PIAO Xiang-lan1,*
(1. Institute of Chinese Minority Traditional Medicine, Minzu University of China, Beijing 100081, China; 2. Mazopathy Prevention and Cure Center, Haidian Maternal and Child Health Hospital, Beijing 100080, China)

Objective: This study aimed to analyze the microbial transformation products of gypenoside ⅩLⅥ. Methods: Gypenoside ⅩLⅥ was transformed by the probiotics Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus grown in skim milk medium. The transformation products were identified by high performance liquid chromatography-ion trap time of flight (LCMS-IT-TOF) mass spectrometry. Results: The products were identified as gypenoside L, gypenoside LI, damulin B and damulin A. Conclusion: More bioactive constituents from the natural product may be obtained by microbial transformation.

microbial transformation; Gynostemma pentaphyllum; gypenoside ⅩLⅥ; Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus

Q939.117

A

1002-6630（2014）17-0133-04

10.7506/spkx1002-6630-201417027

2013-08-17

國家自然科學基金面上項目（81274186）

劉慧敏（1987—），女，碩士研究生，研究方向為微生物轉化。E-mail：huiminliu@yeah.net

*通信作者：樸香蘭（1965—），女，副研究員，博士，研究方向為天然藥物化學。E-mail：xlpiao@163.com