白菜中二硫代磷酸酯類有機磷農藥降解動力學研究

劉 永，姜 冰，吳 巖，魏東旭，曾繁華，閻秀峰

白菜中二硫代磷酸酯類有機磷農藥降解動力學研究

劉 永1,2，姜 冰2，吳 巖2，魏東旭2，曾繁華3，閻秀峰1,*

（1.東北林業大學鹽堿地生物資源環境研究中心，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，黑龍江 哈爾濱 150001；3.大連出入境檢驗檢疫局，遼寧 大連 116600）

培養8 葉期無菌白菜幼苗，添加5 種二硫代磷酸酯類有機磷農藥（馬拉硫磷、樂果、甲拌磷、乙拌磷及特丁硫磷），用氣相色譜及液相色譜-質譜聯用法檢測二硫代磷酸酯類農藥及O,O-二甲基二硫代磷酸酯殘留量。結果表明：二硫代磷酸酯類農藥的含量在實驗過程中呈減少的趨勢，農藥在樣本培養過程被逐漸降解，10 d內降解水平為13.4%～65.0%，無菌苗添加藥物組降解速率明顯低于正常培養添加藥物對照組。使用一級反應動力學模型對農藥代謝動力學進行評價，無菌條件下馬拉硫磷降解速率最快，降解速率常數為0.034 67，降解半衰期為19.9 d，特丁硫磷降解速率常數最小，降解速率常數為0.007 17，降解半衰期為96.7 d，樂果、甲拌磷及乙拌磷相對穩定，但降解動力學差別較大。

白菜；有機磷農藥；降解動力學

有機磷農藥具有廣譜、高效等眾多優點，是當前農藥的三大支柱之一，經過半個世紀的不斷發展，不論品種數量、產量規模等都位居各種農藥首位[1]。有機磷農藥在農業的廣泛應用可能污染土壤、地表水及生物等，并最終傳遞于食品[2-5]。二硫代磷酸酯類有機磷農藥是農業生產中最常用一類農藥，多數毒性較強，殺蟲效果好，降解周期長。主要種類有馬拉硫磷、甲拌磷、乙拌磷、特丁硫磷及樂果等（圖1），其主要中間體及代謝產物為O,O-二甲基二硫代磷酸酯或O,O-二乙基二硫代磷酸酯，也可以降解為其他小分子化合物[6-9]，蔬菜中二硫代磷酸酯類有機磷農藥及其代謝物在日常的例行監測中常有檢出。

圖1 二硫代磷酸酯類農藥的結構圖Fig.1 Structures of dithio organophosphorus pesticides

二硫代磷酸酯類有機磷農藥的降解主要是通過在光照、水分及溫度等條件下的水解作用[10-13]、微生物及其他生物體的生物降解等[14-15]。本實驗考慮到自然條件下微生物的影響，以無菌白菜（Brassica rapa pekinensis）為生物模型，施藥后用氣相色譜及液相色譜-質譜方法檢測二硫代磷酸酯類有機磷農藥的變化。通過監測藥物的代謝過程，根據農藥降解規律，用一級動力學生物降解模型，研究二硫代磷酸酯類農藥的降解過程及降解動力學，為有機磷農藥的生物學降解提供基礎數據，探求蔬菜中二硫代磷酸酯類有機磷農藥的降解動力學規律。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白菜種子 黑龍江農業科學院蔬菜研究所。

有機磷農藥及代謝產物標準品：馬拉硫磷（99.5%）、甲拌磷（99.5%）、乙拌磷（99.5%）、特丁硫磷（99.6%） 瑞士Fluka公司；樂果（99.8%） 美國Sigma公司；O,O-二甲基二硫代磷酸酯（97%） 中國維賽諾化學技術有限公司；標準品用丙酮溶解，4 ℃冰箱保存，使用時用丙酮稀釋至所需質量濃度；丙酮為色譜純試劑；乙酸乙酯為分析純試劑；500 mg 6 mL活性碳固相萃取柱小柱 美國Supelco公司。

1.2 儀器與設備

7890 N型氣相色譜儀（配火焰光度檢測器和磷濾光片） 美國Agilent公司；UPLC-XEVO TQ液相色譜-質譜/質譜聯用儀（配電噴霧離子源） 美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 無菌白菜幼苗培養及處理

白菜種子經體積分數70%酒精浸泡30 s，無菌水洗3 次后在無菌、25 ℃條件下靜置24 h，將種子點播于裝有約15 mL營養瓊脂培養基的培養皿（質量分數1.0%），37 ℃高溫催芽48 h，挑出無菌芽苗，移植2 000 mL三角瓶內，按30 ℃光照期/25 ℃黑暗期培養，每隔3 d更換一次營養液，并對培養液進行菌檢。

以8 葉期白菜幼苗為研究對象，將無菌白菜的培養基添加農藥并進行更換，添加量為10.0 mg/kg，24 h后將10 組樣本（每組15 株，每株在250 mL三角瓶中單獨培養）移植至新培養基中進行無菌培養，不再更換培養基（對照組取培養基相同量土壤，并加入等量水），同時檢測樣本及對照組農藥含量，之后每48 h進行一次取樣檢測，分別對培養0、2、4、6、8、10 d白菜進行檢測。

1.3.2 前處理

取一株樣本，稱取后（精確到0.01 g）用剪刀進行破碎，置于150 mL小燒杯中，加入40 mL乙酸乙酯，均質器均質2 min（不低于10 000 r/min），然后用50 mL離心管4 000 r/min離心5 min，取20 mL上層清液，過500 mg 6 mL活性碳（小柱經5 mL乙酸乙酯活化處理），再用10 mL乙酸乙酯洗脫小柱，流出液旋轉蒸發至近干，用丙酮定容待測定；液相色譜-質譜檢測用乙腈-5 mmol/L乙酸氨（3∶7，V/V）定容。

1.3.3 氣相色譜條件

Agilent 7890氣相色譜儀，配火焰光度檢測器；毛細管氣相色譜柱：DB-1701（30 m×0.250 mm，0.25 μm）；程序升溫：100 ℃ 1 min→10 ℃/min→210 ℃10 min；進樣口溫度：280 ℃；檢測器溫度：250 ℃；載氣：高純氮氣；進樣量：1.0 μL。采用保留時間定性，外標法定量計算。

1.3.4 液相色譜-質譜條件

液相色譜為Waters ACQUITY Ultra Performance液相色譜系統，并配有溶劑管理器，液相色譜柱采用ACQUITY UPLC BEH HILIC（50 mm×2.1 mm，1.7 μm），柱溫30 ℃，流動相：乙腈-5 mmol/L乙酸氨（30∶70，V/V），流速為0.25 mL/min，進樣器用強溶劑（30%乙腈）和弱溶劑（70%乙腈）清洗。

Waters XEVO TQ三重四極質譜儀，并配有電噴霧離子源，多反應監測負模式，檢測條件為：毛細管電壓2.5 kV；離子源溫度150 ℃；脫溶劑氣N2（650 L/h）；霧簾氣N2（50 L/h）；脫溶劑氣溫度400 ℃；錐空電壓30 V；子離子的碰撞能量分別為20 eV和15 eV；駐留時間：50 ms，母離子：m/z 157.0，子離子為m/z 111.9 和m/z 141.9，其中為定量離子m/z 141.9；使用MassLynx v 4.1系統進行數據處理。

2 結果與分析

2.1 二硫代磷酸酯類農藥的降解

有機磷農藥一般采用氣相色譜-火焰光度法進行檢測，前處理方法多采用乙酸乙酯、二氯甲烷等極性較強的有機試劑提取[16-17]，并根據基質的情況采用不同的凈化方式。本研究所使用的二硫代磷酸酯類有機磷農藥的檢測方法與以上方法基本一致，5 種有機磷農藥檢測方法的回收率為85.8%～108.7%，精密度范圍為2.13%～5.25%，檢出限范圍為0.005～0.01 mg/kg，在0.0 1～1.0 0 m g/k g范圍內線性相關系數為0.998 9～0.999 7，典型色譜圖如圖2，分離及凈化效果較好。

圖2 二硫代磷酸酯類有機磷農藥標準品（a）及樣本（b）氣相色譜圖Fig.2 Gas chromatograms of dithio organophosphorus pesticide standards (a) and samples (b)

白菜樣本添加二硫代磷酸酯類農藥，10 d內長勢與對照組無明顯差異，樣本與培養基總質量差異不大，均在75.28～80.86 g之間（對照組包括土壤），實驗組與對照組之間最大差異為1.87 g，無規律分布。樣本在0～10 d內，除0 d樣本只檢測白菜樣本，其余每隔2 d將樣本及培養基進行提取和凈化，用氣相色譜法進行檢測。由表1可知，樣本中二硫代磷酸酯類農藥的含量呈減少的趨勢，農藥在樣本培養過程被逐漸降解，10 d內降解水平為13.4%～65.0%（相對0 d時的農藥殘留量），降解趨勢與Uygun[18]、Zhao Xinhuai[19]等研究結果一致。

表1 白菜中二硫代磷酸酯類有機磷農藥不同時間的殘留含量x±s,, n=5）Table 1 Residual concentrations of dithio organophosphorus pesticides in Chinese cabbage at different culture time (x±s,, n= 5)

Kralj等[20]研究表明，光照條件下能使有機磷降解，降解常數與光強度有關；李順鵬等[21]將甲基對硫磷的降解菌Alcaligenes sp.接種于含有甲基對硫磷的土壤中，表現了較強的降解農藥殘留的生態效應，稻米與稻殼中甲基對硫磷比對照下降了82.2%～100%，田間實驗中，稻米中的甲基對硫磷含量為0.065 mg/kg；Uygun等[18]研究發現，小麥在室溫下存儲5 個月，4 種有機磷降解了76%～88%[18]。本實驗中5 種二硫代磷酸酯類有機磷農藥的降解過程及規律與以上文獻大致相同，雖然實驗中在無菌條件下進行，但培養基的水分含量高，促進了農藥的降解。

2.2 二硫代磷酸酯類農藥的降解動力學

二硫代磷酸酯類有機磷農藥的降解是一種拐點的降解曲線，符合一級反應動力學模式[22-23]，根據一級反應動力學模型，有機磷農藥的降解速率常數和半衰期可以從表2的數據計算得出。

表2 白菜中二硫代磷酸酯類有機磷農藥降解動力學Table 2 Degradation kinetics of dithio organophosphorus pesticides in Chinese cabbage

由表2可知，二硫代磷酸酯類有機磷農藥在無菌白菜中的降解與對照組差異較為明顯，除2 d時對照組有機磷農藥降解差異較小外，其余均明顯快于對照組，說明微生物在降解過程中起到比較重要的作用。各組實驗包括土培對照組中，馬拉硫磷降解速率最快，降解速率常數為0.034 67，降解半衰期為19.9 d；特丁硫磷降解速率常數最小，降解速率常數為0.007 17，降解半衰期為96.7 d，這個可能與馬拉硫磷的結構與特性有關。5 種二硫代磷酸酯農藥中，馬拉硫磷和樂果磷酸酯結構中含有兩個甲基，其余3 種有機磷農藥均為乙基，由于甲基烷氧基結構的推電子作用小于乙基烷氧基，從而降低了磷原子的親和性，一般情況下甲基磷酸酯結構穩定性比乙基磷酸酯差，更有利于水解效應或生物體中有機磷水解酶對其的攻擊[10,24]；又由于馬拉硫磷S—C結構中，碳原子為一個手性原子，報道稱這種結構的有機磷農藥毒性較低[10]，可能有利生物體的利用和吸收。樂果降解速率較快，除了甲基烷氧基結構外，其中含有的胺甲基結構，更容易形成去甲基化樂果，從而加快了其降解速率。

Zhao Xinhuai等[19]研究牛奶中7 種有機磷農藥在微生物作用下的降解，Uygun等[18]也研究小麥存儲過程中有機磷農藥的降解，都表明馬拉硫磷的穩定性較差，降解速率最快，其他有機磷農藥的降解與本實驗的結果基本一致。

2.3 代謝產物含量分析

圖3 3 O,O-O-二甲基二硫代磷酸酯液相色譜-質譜-Fig.3 Mass spectrum of O,O-dimethyl phosphorodithioate

二硫代磷酸酯類有機磷農藥被生物體酶解、水解、甚至被氧化的過程，馬拉硫磷和樂果主要代謝物為O,O-二甲基二硫代磷酸酯，甲拌磷、乙拌磷和特丁硫磷主要代謝產物為O,O-二乙基二硫代磷酸酯，其他物質如氧化生成硫趕硫酸酯、硫逐磷酸酯類及其他小分子化合物[7]，其含量都較低。由于馬拉硫磷代謝較快，實驗對馬拉硫磷實驗組中O,O-二甲基二硫代磷酸酯的含量進行了檢測。代謝物采用與氣相色譜法相同的前處理方式，液相色譜柱選擇親水相互作用色譜（hydrophilic interaction chromatography，HILIC）柱，以增強極性化合保留，獲得較好的分離效果；代謝物的檢測方法的回收率為71.4%～98.3%，精密度為7.30%，檢出限為0.01 mg/kg，在0.01～1.00 mg/kg范圍內線性相關系數為0.998 2，分析方法滿足檢測要求，典型質譜圖如圖3。

圖4 馬拉硫磷實驗組O,O-二甲基二硫代磷酸酯含量變化Fig.4 Change in O,O-dimethyl phosphorodithioate content in Chinese cabbage cultured in the presence of malathion

由圖4可知，對降解速率較快的馬拉硫磷實驗組進行代謝物檢測，O,O-二甲基二硫代磷酸酯含量是一個迅速增加，并逐漸恒定的過程，這可能與O,O-二甲基二硫代磷酸酯結構的穩定性有關，生物降解和水解生成的O,O-二甲基二硫代磷酸酯，又被生物體酶解或水解。

3 結 論

培養8 葉期無菌白菜幼苗，添加10.0 mg/kg馬拉硫磷、樂果、甲拌磷、乙拌磷及特丁硫磷，樣本中二硫代磷酸酯類農藥的含量逐漸降解，10 d時降解水平為13.4%～65.0%。使用一級反應動力學模型對農藥代謝動力學進行評價，無菌條件下馬拉硫磷降解速率最快，特丁硫磷降解速率常數最小，樂果、甲拌磷及乙拌磷相對穩定，但降解動力學差別較大。

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Degradation Kinetics of Dithio Organophosphorus Pesticides in Cabbage

LIU Yong1,2, JIANG Bing2, WU Yan2, WEI Dong-xu2, ZENG Fan-hua3, YAN Xiu-feng1,*
(1. Alkali Soil Natural Environmental Science Center, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China; 2. Technology Center of Heilongjiang Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Harbin 150001, China; 3. Dalian Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Dalian 116600, China)

Seedlings of eight-leafed Chinese cabbage (Brassica rapa pekinensis) were cultured in germ-free conditions supplemented with five dithiophosphate organophosphorus pesticides including malathion, dimethoate, phorate, disulfoton and terbufos. The residues of the organophosphorus pesticides and O,O-dimethyl phosphorodithioate in the seedlings of Chinese cabbage were determined by gas chromatography-liquid chromatography-mass spectrometry (GC-MS). As the culture period progressed, the contents of all these dithiophosphate pesticides decreased and were degraded by 13.4%-65.0% in 10 days. The dithiophosphate pesticides in Chinese cabbage seedlings were degraded significantly slower under germfree culture conditions than under normal culture conditions. The metabolic kinetics of the pesticides followed a first-order kinetic model. Under sterile conditions, malathion was degraded fastest with a rate constant of 0.034 67 and a half life of 19.9 d, Terbufos showed the smallest degradation rate constant of 0.007 17, and the degradation half life was 96.7 days. Dimethoate, phorate and disulfoton were more stable, but the degradation kinetic parameters considerably varied among them.

Brassica rapa pekinensis; dithio organophosphorus pesticides; degradation kinetics

TS201.6

A

1002-6630（2014）17-0094-05

10.7506/spkx1002-6630-201417019

2013-10-23

國家質檢總局科技計劃項目（2009IK177）

劉永（1976—），男，高級工程師，碩士，研究方向為食品安全。E-mail：liuyciq@163.com

*通信作者：閻秀峰（1965—），男，教授，博士，研究方向為細胞生物學。E-mail：xfyan@nefu.edu.cn