短瓣金蓮花不同提取部位的抗氧化活性

樊肇勝，程 佳，王利軍，李丹丹，秦 莉，張艷玲，董阿力德爾圖，朝格圖

短瓣金蓮花不同提取部位的抗氧化活性

樊肇勝，程 佳，王利軍，李丹丹，秦 莉，張艷玲*，董阿力德爾圖，朝格圖

（內蒙古大學化學化工學院，內蒙古 呼和浩特 010021）

目的：研究短瓣金蓮花的抗氧化活性部位。方法：將短瓣金蓮花藥材依次用石油醚、乙酸乙酯、95%乙醇、60%乙醇、30%乙醇和去離子水提取，采用紫外-可見分光光度法對不同溶劑提取部位的黃色素、總黃酮和總酚含量進行分析，并測試各提取部位對羥自由基（·OH）和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基的清除作用以對其抗氧化活性進行研究。結果：短瓣金蓮花石油醚提取部位的黃色素含量最高，為（11.37±0.07 ）mg/g；而60%乙醇提取部位總黃酮和總酚含量最高，分別為（213.21±1.12）mg/g和（121.75±0.58） mg/g，95%乙醇提取部位次之，分別為（200.47±0.65）mg/g和（105.19±0.61）mg/g。石油醚提取部位清除·OH能力最強，半抑制濃度（50% inhibiting concentration，IC50）為92.77 mg/L；95%乙醇提取部位清除DPPH自由基能力最強，IC50為10.14 mg/L，60%乙醇提取部位次之，IC50為10.70 mg/L。結論：短瓣金蓮花清除·OH能力與黃色素含量呈正相關性，而清除DPPH自由基能力與黃酮和多酚含量呈正相關性；短瓣金蓮花的石油醚和95%乙醇提取部位是最佳的抗氧化活性部位，有待進一步深入研究。

短瓣金蓮花；抗氧化活性部位；黃色素；總黃酮；總酚；羥自由基；DPPH自由基

短瓣金蓮花（Trollius ledebouri Reichb.）為毛茛科金蓮花屬多年生草本植物，在我國主要分布于黑龍江及內蒙古東北部等地區，其花為蒙藥金蓮花（阿拉藤花-其其格）的藥用品種之一，具有清熱解毒、消腫、明目等功效，主治感冒發熱、咽喉腫痛、急性鼓膜炎和急性淋巴管炎，在民間亦作保健茶飲用[1-4]。研究發現，短瓣金蓮花與金蓮花類似，主要含有黃酮類、黃色素、生物堿、揮發油、鞣質及有機酸等化學成分，具有抗氧化、抑菌、抗病毒、抗炎、鎮痛等活性[5-14]。現代藥理研究表明黃酮類化合物為金蓮花屬植物主要有效成分，生藥鑒別和藥品質量評價也均以黃酮類成分葒草苷、牡荊苷等為指標[6]。李楠[15]、趙二勞[16]、侯濱濱[17]等發現金蓮花中黃酮類化合物對食用油脂具有較強的抗氧化作用，且不會造成健康損害，具有良好的開發前景。此外，金蓮花中含有大量黃色素，其主要成分為葉黃素-環氧化合物及金蓮花黃質，屬于類胡蘿卜素類成分，具有良好的抗氧化活性，但其研究較少[18-19]。本實驗系統研究了短瓣金蓮花不同溶劑提取部位黃色素、總黃酮和總酚含量及其清除羥自由基（·OH）和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基的能力，為其臨床藥用和天然抗氧化劑的進一步開發提供實驗依據和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金蓮花藥材購自亳州市京皖中藥飲片廠（產地：東北），經鑒定為毛莨科植物短瓣金蓮花的干燥花。

石油醚（沸點60～90 ℃）、乙酸乙酯、95%乙醇、硫酸亞鐵、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鈉、雙氧水（均為分析純） 天津市北聯精細化學品開發有限公司；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、碳酸鈉（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；DPPH（純度≥96%）、焦性沒食子酸（分析純）、鄰二氮菲 阿拉丁試劑有限公司；蘆丁標準品（色譜純≥98%） 北京世紀奧科生物技術有限公司；抗壞血酸 天津市光復精細化工研究所。

1.2 儀器與設備

U-3900H紫外-可見分光光度計 日本日立公司；RE-52旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；SHB-Ⅲ循環水式真空泵 鞏義予華儀器公司；DZF-6090真空干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司；MILLI-Q DIRECT 8超純水器 美國Millipore公司；VFD-1000冷凍干燥機北京博醫康實驗儀器有限公司；FA1004分析天平 上海精天電子儀器有限公司；pH計 奧豪斯儀器上海有限公司；DF-101XP集熱式水浴鍋 江蘇正基儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 短瓣金蓮花的提取

將干燥短瓣金蓮花稱取適量，粉碎，依次分別用石油醚（沸點60～90 ℃）、乙酸乙酯、95%乙醇、60%乙醇、30%乙醇和去離子水加熱回流提取，各3 次，將各提取液過濾、減壓濃縮并冷凍干燥后得到各提取部位。

1.3.2 黃色素含量的測定

黃色素的含量以葉黃素計。葉黃素在波長（446±1）nm處有最大吸收，可根據該波長處測定吸光度和標準百分吸光系數E1%1cm計算其含量。試樣中黃色素含量X以質量分數（%）表示[20]，其計算見公式（1）。

式中：A為短瓣金蓮花各提取部位吸光度；N為稀釋倍數；m為短瓣金蓮花各提取部位質量/g；2 550為葉黃素百分吸光系數（E1%1cm）。

以適當乙醇-水溶液配制短瓣金蓮花石油醚、乙酸乙酯、95%乙醇、60%乙醇、30%乙醇和去離子水提取部位的測試溶液。用紫外-可見分光光度計測定，以無水乙醇為空白對照，在447 nm波長處測定短瓣金蓮花各提取部位的吸光度，將檢測得到的吸光度代入公式（1），得到短瓣金蓮花不同提取部位的黃色素含量。

1.3.3 總黃酮含量的測定

[15-16,21]，以蘆丁作對照品，測定短瓣金蓮花不同提取部位的總黃酮含量。準確吸取60%的乙醇配制質量濃度為0.6 mg/mL的蘆丁標準溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別置于10 mL試管內，相應加入2.0、1.8、1.6、1.4、1.2、1.0 mL的60%乙醇溶液；再加入0.5 mL 5%亞硝酸鈉溶液搖勻，放置6 min；加入0.5 mL 10%硝酸鋁溶液，放置6 min；加入4.0 mL 4%氫氧化鈉溶液，最后加60%乙醇溶液定容到10 mL，搖勻后，放置15 min；在505 nm波長處測定吸光度。用0.0 mL蘆丁標準溶液作為空白，以蘆丁質量濃度（9.15×10-3、18.30×10-3、27.45×10-3、36.60×10-3、45.75×10-3mg/mL）為橫坐標、吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，得到回歸方程為：y= 56.225x+0.221 5（R2=0.998 8）。短瓣金蓮花不同提取部位分別配制成溶液后同法測定，將吸光度代入上述標準曲線方程得到短瓣金蓮花不同提取物中總黃酮的含量。實驗重復3 次。

1.3.4 總酚含量的測定

參考文獻[22-23]，以焦性沒食子酸作對照品，采用Folin-Ciocalteu法測定短瓣金蓮花不同提取部位的總酚含量。精確吸取質量濃度為0.020 mg/mL的焦性沒食子酸溶液0.00、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 mL，分別置于10 mL比色管中，均加入5 mL去離子水、0.5 mL Folin-Ciocalteu試劑，1 min后加入1.5 mL質量濃度為75.0 mg/mL的Na2CO3溶液，去離子水定容至刻度，搖勻，75 ℃水浴反應10 min。在最大吸收波長767 nm處測定吸光度。用0.00 mL焦性沒食子酸溶液作為空白，以焦性沒食子酸質量濃度（5×10-4、10×10-4、15×10-4、20×10-4、25×10-4mg/mL）作為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線，得到回歸方程為：y=37.933x-0.317 5（R2=0.996 9）。短瓣金蓮花不同提取部位分別配制成溶液后同法測定，將吸光度代入上述標準曲線方程得到短瓣金蓮花不同提取物中總酚的含量。實驗重復3 次。

1.3.5 對·OH清除作用的測定

利用鄰二氮菲法，精確移取0.5 mL 0.75 mmol/L的鄰二氮菲溶液、1 mL pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered solution，PBS）和0.5 mL雙蒸水，搖勻，再加入0.5 mL 0.75 mmol/L的硫酸亞鐵溶液，搖勻，最后再加入0.5 mL 0.01%過氧化氫溶液，37 ℃恒溫水浴60 min，在509.5 nm波長處測定其吸光度，記作A損；另一比色管中用0.5 mL雙蒸水代替0.5 mL過氧化氫，測定其吸光度，記作A未；再在一比色管中用不同質量濃度梯度的VC對照溶液或短瓣金蓮花不同溶劑提取部位樣品溶液代替0.5 mL雙蒸水，在509.5 nm波長處測其吸光度，記作A樣。平行測定3 次，記錄吸光度，按式（2）計算不同質量濃度VC對照溶液或短瓣金蓮花不同溶劑提取部位樣品溶液對·OH的清除率（S/%），并計算出半抑制濃度（50% inhibiting concentration，IC50）。

1.3.6 對DPPH自由基清除作用的測定

參考文獻[24-25]的方法，將短瓣金蓮花不同溶劑提取部位用60%乙醇配成1 g/L的溶液，VC用去離子水配成0.1 g/L的溶液，用時稀釋至質量濃度1、2、3、4、5 mg/L。DPPH用60%乙醇配成65 μmol/L的溶液，依注解加樣于具塞比色管中，搖勻反應30 min后，用紫外-可見分光光度計于520 nm（DPPH最大吸收波長）處測定吸光度（60%乙醇溶液為參比）。取3 次實驗的平均值按式（3）計算其清除率并得出IC50。

式中：S為DPPH自由基清除率/%；A0為1.5 mL 65 μmol/L DPPH溶液加入1.5 mL 60%乙醇溶液的吸光度；Ai為1.5 mL 65 μmol/L DPPH溶液加入1.5 mL樣品溶液的吸光度；Aj為1.5 mL 60%乙醇溶液加入1.5 mL樣品溶液的吸光度。

2 結果與分析

2.1 短瓣金蓮花不同提取部位的提取率

表1 短瓣金蓮花不同溶劑提取部位的提取率Table 1 Extraction rates from the flowers Trollius ledebouri by different solvents

由表1可知，短瓣金蓮花95%乙醇、石油醚和60%乙醇提取部位的樣品量較多，分別占到總提取率的29.67%、25.03%、20.18%。

2.2 短瓣金蓮花不同提取部位的黃色素含量

圖1 短瓣金蓮花不同提取部位的黃色素含量與對·OH的清除作用Fig.1 Yellow pigment content and hydroxyl radical scavenging effects of different solvent extracts from the flowers of Trollius ledebouri

由圖1可知，短瓣金蓮花石油醚提取部位中黃色素含量最多，為（11.37±0.07）mg/g，其次為乙酸乙酯提取部位和去離子水提取部位，分別為（2.77±0.16）mg/g和（2.10±0.14）mg/g，95%、60%和30%乙醇提取部位中黃色素含量相當，分別為（1.17±0.07）、（1.27±0.07）、（1.17±0.07）mg/g。

2.3 短瓣金蓮花不同提取部位的總黃酮含量

圖2 短瓣金蓮花不同提取部位的總黃酮和總酚含量與對DPPH自由基的清除作用Fig.2 Contents of total flavonoids and total phenols, and DPPH radical scavenging effects of different solvent extracts from the flowers of Trollius ledebouri

由圖2可知，短瓣金蓮花60%乙醇溶劑提取部位中的總黃酮含量最高，為（213.21±1.12）mg/g；95%乙醇提取部位次之，為（200.47±0.65）mg/g；石油醚提取部位含量最低，為（17.60±0.39）mg/g。

2.4 短瓣金蓮花不同提取部位的總酚含量

由圖2可知，短瓣金蓮花60%乙醇溶劑提取部位中的總酚含量最高，為（121.75±0.58）mg/g；95%乙醇提取部位次之，為（105.19±0.61）mg/g；石油醚和去離子水提取部位總酚含量最低，分別為（14.79±0.22）mg/g和（15.41±0.05）mg/g。

2.5 短瓣金蓮花不同提取部位對·OH的清除作用

表2 短瓣金蓮花不同提取部位和VC對OH的清除作用Table 2 Hydroxyl radical scavenging effects of different solvent extracts from the flowers of Trollius ledebouri

由表2可知，測得短瓣金蓮花不同提取部位對·OH的清除能力由大到小依次為：VC＞石油醚提取部位＞乙酸乙酯提取部位＞95%乙醇提取部位＞60%乙醇提取部位＞去離子水提取部位＞30%乙醇提取部位，其中，石油醚、乙酸乙酯和95%乙醇提取部位的清除能力較強，IC50分別為92.77、106.54、110.90 mg/L。進一步比較短瓣金蓮花不同提取部位的黃色素含量與對·OH的清除能力（圖1）發現，黃色素含量與對·OH的清除能力呈現一定的正相關性。

2.6 短瓣金蓮花不同提取部位對DPPH自由基的清除作用

表3 短瓣金蓮花不同提取部位和VC對DPPH自由基的清除作用Table 3 DPPH radical scavenging effects of different solvent extracts from the flowers of Trollius ledebouri

由表3可知，短瓣金蓮花不同溶劑提取部位對DPPH自由基的清除能力依次為：VC＞95%乙醇提取部位＞60%乙醇提取部位＞乙酸乙酯提取部位＞30%乙醇提取部位＞去離子水提取物部位＞石油醚提取部位，其中，95%提取部位清除DPPH自由基的能力是最強的，IC50值為10.14 mg/L，60%乙醇提取部位次之，IC50值為10.70 mg/L，與對照VC（IC50=2.44 mg/L）較為接近。進一步比較短瓣金蓮花不同提取部位的總黃酮和總酚含量與對DPPH自由基的清除能力（圖2）發現，總黃酮和總酚含量與對DPPH自由基的清除能力呈現一定的正相關性。

3 結 論

本實驗發現，短瓣金蓮花石油醚提取部位提取率較高、黃色素含量最高、總黃酮和總酚含量最低、清除·OH能力最強；95%和60%乙醇提取部位提取率亦較高、黃色素含量最低、總黃酮和總酚含量最高、清除DPPH自由基的能力最強；而乙酸乙酯部位提取率最低、黃色素、總黃酮和總多酚含量均較低、清除·OH和DPPH自由基的能力較弱。短瓣金蓮花清除·OH的能力與黃色素含量呈正相關性，而清除DPPH自由基的能力與總黃酮和總酚含量呈正相關性。不同部位清除不同類型自由基的能力不同。

綜合分析短瓣金蓮花對·OH和DPPH自由基的能力，可知其石油醚、乙酸乙酯、95%和60%乙醇提取部位均具有一定的抗氧化活性。而進一步結合各部位提取率的情況，可知石油醚和95%乙醇提取部位是短瓣金蓮花的最佳抗氧化活性部位。短瓣金蓮花含有黃酮類、黃色素、生物堿、揮發油、鞣質及有機酸等化學成分，其抗氧化活性是其中所含有多種成分綜合作用的結果。這兩個活性部位除含黃色素和黃酮類成分外，可能還含有其他具有抗氧化活性的化學成分，具體還含有哪些抗氧化活性成分、其抗氧化能力以及作用機理有何區別、各個成分之間有無協同作用，有待進一步深入研究。

參考文獻：

[1] 《中華本草》編委會. 中華本草(第七卷)[M]. 上海: 上海科學技術出版社, 1999: 277.

[2] 中華人民共和國衛生部. 中華人民共和國衛生部藥品標準(蒙藥分冊)[M]. 北京: 人民衛生出版社, 1998.

[3] 李良千. 毛茛科金蓮花亞科植物的地理分布[J]. 植物分類學報, 1995, 33(6): 535-537.

[4] 中國植物志編委會. 中國植物志[M]. 北京: 科學出版社, 1997: 27-70.

[5] 邢蕊. 短瓣金蓮花藥效學及質量標準研究[D]. 哈爾濱: 黑龍江中醫藥大學, 2012.

[6] 唐津忠, 魯曉翔, 陳瑞芳. 金蓮花中黃酮類化合物的提取及其抗氧化性研究[J]. 食品科學, 2003, 24(6): 88-91.

[7] 周欣, 范國榮, 吳玉田. 短瓣金蓮花總黃酮及指標性成分的體外抗氧化活性研究[J]. 中藥材, 2007, 30(8): 1000-1002.

[8] ZOU Jianhua, YANG Junshan, ZHOU Liang. Acylated flavone C-glycosides from Trollius ledebouri[J]. Journal of Natural Products, 2004, 67(4): 664-667.

[9] ZHOU Xin, PENG Jinyong, FAN Guorong, et al. Isolation and purification of flavonoid glycosides from Trollius ledebouri using high-speed counter-current chromatography by stepwise increasing the flow-rate of the mobile phase[J]. Journal of Chromatography A, 2005, 1092(2): 216-221.

[10] WU Xinan, ZHAO Yimin, YU Nengjiang. Flavone C-glycosides from Trollius ledebouri reichb[J]. Journal of Asian Natural Products Research, 2006, 8(6): 541-544.

[11] ZOU Jianhua, YANG Junshan, DONG Yuesheng, et al. Flavone C-glycosides from flowers of Trollius ledebouri[J]. Phytochemistry, 2005, 66(10): 1121-1125.

[12] ZOU Jianhua, YANG Junshan, ZHOU Liang. A new labdane type diterpenoid from Trollius ledebouri[J]. Natural Product Research, 2006, 20(12): 1031-1035.

[13] 吳新安, 秦峰, 都模勤. 短瓣金蓮花揮發油成分的氣相色譜-質譜聯用分析[J]. 解放軍藥學學報, 2011, 27(6): 519-520.

[14] 王如峰, 劉瑞凝, 賡迪. 短瓣金蓮花的揮發性成分研究[J]. 時珍國醫國藥, 2011, 22(6): 1382-1383.

[15] 李楠, 葉春華, 呂艷蓓. 金蓮花中黃酮類化合物抗氧化能力的研究[J].食品研究與開發, 2010, 31(11): 77-79.

[16] 趙二勞, 趙小花, 范建鳳. 金蓮花黃酮微波輔助提取及其抗氧化性[J].食品與生物技術學報, 2009, 28(1): 81-85.

[17] 侯濱濱. 金蓮花中黃酮類物質對食用油脂的抗氧化性能研究[J]. 天津化工, 2011, 25(2): 42-43.

[18] 張瑞宇, 王文娟. 金蓮花天然色素的提取方法與穩定性研究[J]. 食品研究與開發, 2007, 28(3): 60-65.

[19] 高彥祥, 李媛媛. 天然色素抗氧化性研究進展[J]. 食品科學, 2005, 26(增刊1): 139-144.

[20] 趙小陽, 田河山. 葉黃素的測定方法研究[J]. 飼料廣角, 2007, 19(21): 41-42.

[21] 申海進, 郭巧生, 房海靈. 野菊花60%乙醇提取物的酚類成分組成及其清除自由基和防霉變能力分析[J]. 植物資源與環境學報, 2010, 19(1): 20-25.

[22] 趙二勞, 姚宇霞, 史淑美, 等. 秦皮不同溶劑提取物總酚含量及抗氧化活性[J]. 中國食品添加劑, 2012, 19(3): 116-119.

[23] 曹艷萍, 代宏哲, 曹煒, 等. Folin-Ciocaileu比色法測定紅棗總酚[J].安徽農業科學, 2008, 36(4): 1299; 1302.

[24] 魏紅, 豐帆, 陳旭丹, 等. 4種中藥黃酮提取物清除自由基活性的研究[J]. 天津師范大學學報: 自然科學版, 2008, 28(2): 14-17.

[25] 顏娟, 胡海娜, 田嘉銘, 等. 金蓮花中總黃酮抗氧化作用的研究[J].時珍國醫國藥, 2010, 21(2): 386-387.

Antioxidant Activity of Different Solvents Extracts from Flowers of Trollius ledebouri Reichb

FAN Zhao-sheng, CHENG Jia, WANG Li-jun, LI Dan-dan, QIN Li, ZHANG Yan-ling*, DONG Alideertu, Tsogt
(School of Chemistry and Chemical Engineering, Inner Mongolia University, Hohhot 010021, China)

Purpose: To explore the antioxidant activity of different solvent extracts from the flowers of Trollius ledebouri Reichb. Methods: The dried flowers were extracted sequentially with petroleum ether, ethyl acetate, 95% ethanol, 60% ethanol, 30% ethanol and deionized water. Each extract obtained was analyzed by ultraviolet-visible spectrophotometry for the contents of yellow pigment, total flavonoids and total polyphenols, and their radical scavenging activity against hydroxyl and DPPH free radicals were tested. Results: Petroleum ether extract had the highest content of yellow pigment (11.37 ± 0.07) mg/g; 60% ethanol extract from the flowers of Trollius ledebouri had the highest content of total flavonoids (213.21 ± 1.12) mg/g and total polyphenols (121.75 ± 0.58) mg/g, 95% ethanol extract had slightly lower contents of total flavonoids (200.47 ± 6.49) mg/g and total polyphenols (105.19 ± 0.61) mg/g. Petroleum ether extract had the strongest hydroxyl radical scavenging ability with IC50of 92.77 mg/L, while 95% ethanol extract had the strongest DPPH radical scavenging ability with IC50of 10.14 mg/L and 60% ethanol extract had slightly lower DPPH radical scavenging ability with IC50of 10.70 mg/L. Conclusion: The hydroxyl radical scavenging capacity presented a positive correlation with the concentration of yellow pigment, and the DPPH radical scavenging capacity presented a positive correlation with the concentration of total flavonoids and total polyphenols; petroleum ether and 95% ethanol extracts from the flowers of Trollius ledebouri have potent antioxidant activity.

flowers of Trollius ledebouri; antioxidant extracts; yellow pigment; total flavonoids; total polyphenols; hydroxyl radical; DPPH radical

R932；Q949.95

A

1002-6630（2014）17-0012-05

10.7506/spkx1002-6630-201417003

2013-10-19

國家自然科學基金地區科學基金項目（31160332）；內蒙古自治區高等學校科學技術研究項目（NJZZ13015）；內蒙古大學高層次人才引進科研啟動項目（Z20100108）

樊肇勝（1993—），男，本科，主要從事天然產物研究。E-mail：fanzhaoshengfzs@163.com

*通信作者：張艷玲（1979—），女，講師，博士，主要從事天然產物研究。E-mail：zhylthu@126.com