p53、Bcl-2及Bax在大腸腺癌中的表達(dá)及臨床意義

蘇 銳，劉 娜，路 艷，侯 雷，李英健，趙恩宏，劉志滿，申興斌

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，河北承德067000)

近年研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡受抑制與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［1］。p53是一種重要的細(xì)胞凋亡相關(guān)因子，可分為野生型和突變型。野生型p53可促進(jìn)細(xì)胞調(diào)亡，而突變型p53可抑制細(xì)胞凋亡。Bcl-2和Bax是凋亡調(diào)節(jié)基因Bcl-2家族的兩個重要成員。Bcl-2主要是抑制細(xì)胞凋亡，Bax則是促進(jìn)細(xì)胞凋亡，故Bcl-2/Bax與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切［2］。2010年7月～2011年4月，我們觀察了大腸腺癌中p53、Bcl-2和Bax的表達(dá)，并分析其與患者臨床病理特征的關(guān)系。現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇同期我院手術(shù)切除的大腸腺癌組織50份，均經(jīng)病理檢查確診。其中患者男30例、女20例，年齡31～78歲、平均59歲;細(xì)胞分化程度:高分化16例，中分化23例，低分化11例;浸潤深度:未穿透肌層14例，穿透肌層36例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移:無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移24例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移26例;Dukes臨床病理分期:A+B期24例，C+D期26例;患者術(shù)前未接受放化療。取上述大腸腺癌標(biāo)本的切緣，經(jīng)病理證實為大腸正常黏膜組織的有15份，患者男8例、女7例，年齡31～78歲、平均58歲。同期另收集大腸腺瘤組織20份，患者男10例、女10例，年齡35～65歲、平均50歲。各組性別、年齡具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 p53、Bcl-2及Bax檢測 所有組織經(jīng)過甲醛固定、石蠟包埋后，按5 μm厚標(biāo)準(zhǔn)連續(xù)切片，分別行HE和免疫組化染色。具體實驗步驟:①石蠟切片(5 μm)，電熱恒溫箱(80℃)烘烤50 min，二甲苯脫蠟至水;②3%過氧化氫室溫孵育10 min，消除內(nèi)源性過氧化物酶活性;③蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min，在微波爐里加熱0.01 mol/L枸櫞酸鈉緩沖液(pH=6.0)至沸騰后將上述組織切片放入，抗原熱修復(fù)15 min，室溫放置40 min，PBS沖洗3次，每次5 min;④滴加Ⅰ抗50 μL(Clusteirin 1∶100 工作液，Bcl-2 1∶80 工作液，Bax 1∶80 工作液，p53 1∶80 工作液)，4 ℃冰箱過夜;⑤PBS洗3次，每次5 min;⑥滴加Ⅱ抗(快捷型酶標(biāo)羊抗鼠/兔IgG聚合物)，室溫孵育15 min;⑦PBS洗3次，每次5 min;⑧DAB顯色5 min后終止顯色，蒸餾水沖洗;⑨蘇木素復(fù)染，透明、封片、鏡檢。

1.2.2 結(jié)果判定 p53主要定位于細(xì)胞核，以細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為陽性反應(yīng)。Bcl-2及Bax主要定位于細(xì)胞質(zhì)，以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為陽性反應(yīng)。采用陽性染色強(qiáng)度結(jié)合陽性細(xì)胞所占百分比進(jìn)行判斷。在400倍視野下，每張切片隨機(jī)挑取4個視野進(jìn)行觀察，將切片中平均陽性比例及染色深淺分別計0～4分，切片中無陽性細(xì)胞計0分，陽性細(xì)胞＜25%計1分，25% ～50%計2分，51% ～75%計3分，＞75%計4分;染色強(qiáng)度以多數(shù)細(xì)胞為準(zhǔn);無著色計0分，淺棕黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分;這兩項指標(biāo)的積分相加將結(jié)果分為4級:0分為陰性(－)，1～2分為弱陽性(+)，3～4分為中度陽性(++)，5～6分為強(qiáng)陽性(+++)。

1.2.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件，等級資料比較采用秩和檢驗;相關(guān)性分析采用Pearson直線相關(guān)或Spearman等級相關(guān)分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 p53、Bcl-2及Bax在不同類型大腸組織中的陽性表達(dá)比較 見表1。

表1 p53、Bcl-2及Bax在不同類型大腸組織中的陽性表達(dá)比較［例(%)］

2.2 p53、Bcl-2及Bax在大腸腺癌中的陽性表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系 見表2。

表2 p53、Bcl-2及Bax在大腸腺癌中的陽性表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系［例(%)］

2.3 大腸腺癌中 p53、Bcl-2、Bax表達(dá)的相關(guān)性分析 p53的表達(dá)與Bcl-2的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.78，P ＜0.01)，與 Bax的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r= －0.65，P ＜0.01);Bcl-2的表達(dá)與Bax的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=－0.63，P ＜0.01)。

3 討論

p53基因位于人類染色體17p13，因其編碼的核酸蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為53 kD，故而得名。p53以兩種形式存在，即野生型和突變型。野生型是一種抑癌基因，可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤生長;而突變型是一種癌基因，抑制細(xì)胞凋亡，能夠促進(jìn)腫瘤的生長、侵襲及轉(zhuǎn)移。p53是目前發(fā)現(xiàn)的與人類腫瘤關(guān)系最密切的基因，大多數(shù)惡性腫瘤中都可檢測到表達(dá)上調(diào)的 p53 蛋白［3，4］。Doak 等［5］研究發(fā)現(xiàn)，p53 在食管正常黏膜組織中的陽性表達(dá)明顯低于其在不典型增生和原位癌組織中的陽性表達(dá)。劉鵬等［6］研究發(fā)現(xiàn)，在大腸正常黏膜組織、癌旁組織、癌組織中p53蛋白的表達(dá)呈遞增趨勢。袁家賓等［7］研究表明，p53蛋白表達(dá)與大腸腺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及分化程度有關(guān)，而與患者的性別、年齡、腫瘤發(fā)生部位無明顯相關(guān)。本研究結(jié)果與這些前人研究結(jié)果基本一致，說明p53蛋白的突變在大腸腺癌的形成、發(fā)展中起到了促進(jìn)作用。

Bcl-2家族成員在細(xì)胞凋亡的基因調(diào)控過程中具有重要作用［8］。其中Bcl-2是凋亡抑制因子，而Bax則是凋亡誘導(dǎo)因子，Bcl-2/Bax大小決定細(xì)胞凋亡是否發(fā)生。Boudard等［9］研究表明，Bcl-2高表達(dá)的骨髓增生異常綜合征患者預(yù)后差，其抑制腫瘤細(xì)胞凋亡的作用隨表達(dá)水平降低而下降，使腫瘤細(xì)胞在Bax作用下發(fā)生凋亡，從而使腫瘤生長速度減慢、侵襲能力下降，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的概率降低。結(jié)合本研究結(jié)果分析，Bcl-2與Bax的作用互相拮抗，共同影響著腫瘤的生物學(xué)行為和預(yù)后。

本研究還發(fā)現(xiàn)，大腸腺癌組織中的Bcl-2及p53表達(dá)水平明顯高于大腸腺瘤及大腸正常黏膜，大腸正常黏膜Bax的表達(dá)高于大腸腺瘤、大腸腺癌組織。雖然Bcl-2和p53的作用機(jī)制不同，但它們都是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的促進(jìn)因素。有研究表明，同一標(biāo)本中這兩種物質(zhì)的表達(dá)水平具有一致性［10］。本研究結(jié)果也表明，大腸腺癌組織中p53的表達(dá)與Bcl-2呈正相關(guān)，而與Bax呈負(fù)相關(guān)，推測其原因可能是突變型p53對Bcl-2的表達(dá)有上調(diào)作用，而對Bax的表達(dá)有下調(diào)作用，致使細(xì)胞凋亡被抑制;相反，Bcl-2的高表達(dá)和Bax的低表達(dá)可抑制野生型p53的功能，導(dǎo)致細(xì)胞癌變，引起大腸腺癌的發(fā)生。

綜上所述，在大腸腺癌組織中p53、Bcl-2的表達(dá)呈上調(diào)狀態(tài)，Bax的表達(dá)呈下調(diào)狀態(tài)，三者共同參與大腸腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程。

［1］Kukhta VK，Marozkina NK，Sokolchik IG，et al.Molecular mechanisms of apoptosis［J］.Ukr Biokhim Zh，2003，75(6):5-9.

［2］Xu J，Xu Z，Jiang Y，et al.Cryptorchidiam induces mousse testicular germ cell apoptosis and changes in bcl-2 and bax protein expression［J］.J Environ Pathol Toxicol Oncol，2000，19(1-2):25-33.

［3］吳小明.p73基因與p53抑癌基因的比較［J］.惠州學(xué)院學(xué)報，2003，23(6):56-62.

［4］Yamaguchi A，Kurosaka Y，F(xiàn)ushida S，et al.Expression of p53 protein in colorectal cancer and its relationship to short-term prognosis［J］.Cancer，2002，70(12):2778-2784.

［5］Doak SH，Jenking GJ，Parry EM，et al.Characterisation of p53 status at the gene，chromosomal and protein levels in oesophageal adenocarcinoma［J］.Br J Cancer，2003，89(9):1729-1735.

［6］劉鵬，張桂英，李艷春，等.PTEN、p53和PCNA在大腸癌組織的表達(dá)及臨床意義［J］.醫(yī)學(xué)臨床研究，2005，22(9):1227-1229.

［7］袁家賓，張雷，劉啟龍，等.大腸腫瘤p53蛋白表達(dá)及其臨床意義［J］.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2001，24(4):14-16.

［8］Tsukaharas S，Yamamoto S，Tin-Tin-Shwe，et al.Inhalation of low-level formaldehyde increases the Bcl-2/Bax expression ratio in the hippocampus of immunologically sensitized mice［J］.Neuroimmunomodulation，2006，13(2):63-68.

［9］Boudard D，Vasselon C，Bertheas MF，et al.Expression and prognostic significance of Bcl-2 family proteins in myelodysplastic syndromes［J］.Am J Hematol，2002，70(2):115-125.

［10］Mosnier JF，Perret AG，Vindimian M，et al.An immunohistochemical study of the simultaneous expression of bcl-2 and p53 oncoproteins in epithelial tumors of the colon and rectum［J］.Arch Pathol Lab Med，1996，120(7):654-659.