Hedeghog信號通路與胰腺癌治療研究進展

胡佳佳 李淑德 高軍

胰腺導管腺癌(簡稱胰腺癌)是消化系統常見的惡性腫瘤，占胰腺惡性腫瘤的90%以上，近年來發病率呈逐年上升趨勢，居歐美國家癌癥致死病因的第4位。近年來研究發現，Hedgehog信號通路(HH信號通路)在胰腺癌中有不同程度的異常活化，可能是胰腺癌的核心致病機制之一[1-2]。同時，該通路的異常活化對胰腺癌的惡性生物學特性的維持極為重要[3-6]，為研究胰腺癌的發生機制和治療方案提供了全新的方向。目前已經發現或合成的多種化合物，可以在不同的環節阻斷HH信號通路。本文就HH信號通路的阻斷劑及其在胰腺癌治療中的應用做一綜述。

一、Smo抑制劑

Smo抑制劑是目前HH信號通路阻斷劑研究的熱點。現分別就其在胰腺癌細胞株、胰腺癌干細胞、胰腺癌原位異種移植小鼠及藥物臨床試驗方面的研究進行概括。

1．胰腺癌細胞株：作為Smo特異性抑制劑，環巴明是第一個被發現，也是目前臨床最常用的HH信號通路拮抗劑。環巴明是一種從百合類植物中提取的甾體生物堿，通過與Smo的7次跨膜螺旋結合，靶向抑制Smo的活性，從而阻斷HH信號通路的轉導[7]。Thayer等[8]用環巴明與5株人胰腺癌細胞株進行共培養，結果2株Smo高表達細胞株的細胞密度和形態發生顯著變化，與對照組相比凋亡增加2.5～3.5倍，增殖率下降75%～80%。研究還顯示，HH信號通路非依賴的胰腺癌細胞株PANC1、BxPC-3，在給予環巴明干預后，并不能顯著抑制細胞增殖；而HH信號通路依賴的胰腺癌細胞株CFPAC-1，在對吉西他濱不敏感的情況下，環巴明仍然可以顯著抑制細胞增殖[8-9]。因此，環巴明可以引起高表達HH信號通路的胰腺癌細胞發生凋亡，然而對于不表達HH信號通路的胰腺癌細胞則無明顯作用，進一步證實環巴明對HH信號通路的特異性抑制作用，同時提示對環巴明不敏感的胰腺癌細胞可能是通過Smo下游通路發生激活性突變而維持其增殖的。Hu等[10]研究表明，環巴明能使胰腺癌細胞株中表皮生長因子受體(EGFR)的表達減少，單用環巴明，或聯合應用易瑞沙可抑制胰腺癌細胞系PANC1、SUIT 2和ASPC-1的細胞生長，誘導細胞凋亡，使細胞周期阻滯于G0/G1期。兩者在抗胰腺癌細胞增殖中起協同作用。環巴明還能增強紫杉醇和放療對胰腺癌細胞的殺傷作用[11]。

KAAD-cyclopamine是環巴明的衍生物，同樣通過抑制Smo發揮抗HH信號通路的作用。胰腺癌MiaPaCa-2細胞經KAAD-Cyclopamine處理后，細胞中bax蛋白表達顯著上調，Glil蛋白及bcl-2蛋白表達顯著下調，細胞生長受限，凋亡增加，證實胰腺癌細胞內HH信號活性明顯受抑制。目前動物實驗中尚未發現其存在明顯不良反應。AZD8542是一種新型的Smo拮抗劑，Hwang等[12]研究表明，伴隨著HH信號通路下游核轉錄因子Gli1 mRNA表達上調，HH信號通路的激活，可促進胰腺星形細胞增殖。與胰腺癌細胞相反，胰腺星形細胞中Smo受體高表達，而HH配體低表達，AZD8542可抑制胰腺星形細胞的增殖，進而抑制胰腺腫瘤的生長及侵襲轉移。

2．胰腺癌干細胞：腫瘤干細胞與腫瘤侵襲、轉移、復發、放化療抗性等密切相關。胰腺癌干細胞僅占腫瘤細胞的0.2%～0.8%，但致瘤性最強，最早由Li等[13]分離鑒定(CD44+CD24+ESA+)。研究發現只需接種100個腫瘤干細胞即可在裸鼠形成移植瘤，與原發瘤在病理學上十分類似，并且在連續傳代中比例保持不變。胰腺癌干細胞中Shh表達較正常胰腺上皮上調46.3倍，而非干細胞僅上調4倍。HH信號通路在胰腺癌干細胞的維持和自我更新中起至關重要的作用。環巴明可顯著減少胰腺癌干細胞[9,13-15]。Jimeno等[14]的研究還發現單用吉西他濱治療敏感性胰腺癌，雖然出現腫瘤退縮，但同時會引起腫瘤干細胞聚集，停藥后腫瘤又迅速生長。而聯合環巴明治療后，可誘導持續性的腫瘤退縮，清除腫瘤干細胞。Mueller等[15]的研究亦證實環巴明聯合雷帕霉素和吉西他濱可以使胰腺癌干細胞減少至檢測不到的水平，腫瘤轉移能力完全消失，存活細胞株亦完全失去致瘤性。

3．胰腺癌原位異種移植小鼠：Thayer等[8]用對環巴明敏感的胰腺癌細胞株接種裸鼠，并用環巴明進行瘤內注射治療，1周后治療組50%～60%腫瘤的生長受到抑制，腫瘤體積也明顯縮小。Feldmann等[9]研究發現，環巴明可通過下調Snail、Angl和IGF1的表達，上調E-eadherin的表達，抑制腫瘤新生血管形成，抑制上皮間質轉化，進而抑制異種移植胰腺癌的生長、侵襲與轉移。在胰腺癌原位異種移植小鼠中，吉西他濱治療組中3只發生脾轉移、1只發生淋巴結轉移；環巴明治療組中只有1只出現肺的微轉移灶；環巴明和吉西他濱聯合用藥組的所有小鼠均未出現轉移灶，并且原發性腫瘤顯著縮小；而單純對照組的7只小鼠均發生多器官轉移[9]。他們的研究還發現，胰腺癌異種移植小鼠經環巴明治療后，中位生存期由原來的61 d延長至67 d，而且腫瘤侵襲轉移能力明顯受抑制[16]。IPI-926是人工合成的Smo拮抗劑，亦通過抑制Smo發揮作用。研究證實胰腺癌移植小鼠經IPI-926處理后，腫瘤細胞明顯密集，間質結締組織顯著減少，Ⅰ型膠原含量下降，腫瘤平均血管密度(MVD)顯著增高，幾乎達正常胰腺組織水平，腫瘤組織中吉西他濱代謝產物濃度增加了60%[17]。

4．藥物臨床試驗：GDC-0449是第一個進入臨床Ⅰ期試驗的Smo拮抗劑，其治療因進展或轉移而不適合手術或放療的基底細胞癌33例，2例得到完全緩解，16例部分緩解，有效率達55%，并未見劑量限制性毒性發生[18]。Lorusso等[19]的Ⅰ期臨床試驗證實，68例腫瘤患者中，33例基底細胞癌對GDC-0449有反應，2例患者完全緩解，而且不良反應輕微，如厭食、消瘦、脫發、低鈉血癥等。1例手術、放療、化療后發生全身廣泛轉移的髓母細胞瘤患者，給予誘導化療、自體干細胞移植、替莫唑胺和bevaeizumab等治療后依然不斷進展，采用GDC-0449治療2個月后，PET檢查示病灶幾乎完全消失，遺憾的是，1個月后復查，部分原有病灶復發并出現新病灶，提示腫瘤對HH抑制劑出現耐藥。這是由于Smo基因發生突變，保守的天冬氨酸殘基被替代，使GDC-0449無法和Smo結合抑制HH信號通路[20-21]。到目前為止已經開展了關于GDC-0449對胰腺癌治療療效評估的Ⅰ期、Ⅱ期臨床試驗，但結果尚未見報道[22-23]。IPI-926亦在進展期實體腫瘤的Ⅰ期臨床試驗中取得良好療效[24]。

二、HH蛋白拮抗劑

HH蛋白拮抗劑通過與HH蛋白結合阻斷信號通路的轉導，其主要包括Robotnikinin及SHH蛋白抗體5E1。5E1通過與SHH蛋白結合，阻斷SHH誘導的HH信號通路的活化，進而抑制胰腺癌細胞的生長。Bailey等[25]報道，用5E1處理小鼠的人胰腺癌原位移植瘤后，腫瘤體積明顯縮小，轉移率明顯下降。

三、Gli相關拮抗劑

Lauth等[26]報道，在HEK293細胞中通過瞬時轉染編碼Glil基因和Gli調控的熒光素酶報告基因的質粒cDNA，發現兩個小分子化合物128(GANT61)和129(GANT58)可以抑制NIH 3T3細胞通過Smo激動劑激活的內源性HH信號通路。此外，這兩個化合物可以降低SuFu-/-細胞中Glil和Hip1的表達，提示它們作用于SuFu的下游通路。Glil+細胞系(如胰腺腺癌PANC1)比低Glil細胞系(如肝細胞癌HepG2和白血病Jurkat)對GANT61/GANT58要敏感得多，前兩者抑制率為40%～50%，后兩者僅0～10%。用5 μmmol/L GANT61或GANT58處理PANC1細胞48 h可導致Glil和Ptch表達下降，Gli的抑制尤其明顯。而同樣濃度的環巴明只是輕微抑制Gli1/Ptch的表達，提示該細胞系HH信號通路活化發生在Smo下游。Fu等[27]研究表明，GANT61可以抑制胰腺癌細胞增殖，抑制Gli-DNA結合和轉錄活性，并通過激活caspase-3，裂解多聚ADP核糖聚合酶(PARP)，誘導細胞凋亡。此外，GANT61通過上調E-cadherin，下調N-鈣黏蛋白、轉錄因子(包括Snail、Slug、Zeb1)，從而抑制上皮間質轉化。

四、Sulforaphane(SFN)

SFN是十字花科植物的活性成分。Rodova等[28]研究發現，SFN通過抑制Gli1、Gli2、Smo的表達，抑制HH信號通路的活性。SFN可以抑制SHH信號通路成分Nanog和Oct-4，抑制胰腺癌干細胞的自我更新。同時通過下調Bcl-2、Cyclin D2的表達及激活caspase-3和caspase-7，誘導胰腺癌細胞的凋亡。

除上述拮抗劑外，HH信號通路其他成員的干預對胰腺癌也有抑制作用，如抗Ptch l抗體能抑制HH信號通路和胰腺癌細胞增殖[29]。CUR61414作為Ptch 1抗體，經Williams等[30]研究證實，在皮膚基底細胞癌中，可抑制基底細胞腫瘤的生長，而對正常細胞無影響。但在胰腺癌中的研究尚未見此類報道。構建表達反義Smo的腺病毒載體也能抑制胰腺癌細胞生長[31]。Kim等[32]發現特異性激活肝X受體(1iver X receptors，LXR)可以抑制多能骨髓基質細胞和顱蓋骨細胞對Shh的反應性，降低Gli1的轉錄活性，從而抑制HH靶基因(Gill、Ptch1)表達。采用siRNA技術沉默LXR基因，可以減弱對HH靶基因表達的抑制作用，在不存在LXR的小鼠胚胎成纖維細胞中，LXR配體并不能抑制Hh信號通路，而把LXR基因導入這些細胞中即可重建這種抑制關系。由此提示，LXR或許可以成為HH信號通路的一個新的調控靶點。

HH信號通路與胰腺癌的發生、發展密切相關，以HH信號通路為靶標的治療成為胰腺癌治療的新方法，然而盡管部分HH信號通路拮抗劑在胰腺癌的實驗治療中顯示出良好的應用前景，但亦給我們帶來許多新的思考。Morton等[33]報道由K-ras和HH聯合誘導的腫瘤細胞株，在應用HH信號通路拮抗劑后，盡管上述的信號通路被抑制，而腫瘤細胞仍可繼續增殖。又如應用HH信號通路拮抗劑后出現的快速耐藥現象，HH信號通路抑制劑的毒性問題等。因此深入探討胰腺癌發生的分子機制，以及HH信號通路與其他信號通路之間的相互作用，相信以HH信號通路為靶標的治療，仍然具有較為廣闊的應用前景。

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