響應面法優化枯草芽孢桿菌S0507產四甲基吡嗪的培養條件

祝賽峰，吳建峰，趙希榮,*

（1.淮陰工學院生命科學與化學工程學院，江蘇 淮安 223003；2.江蘇今世緣酒業有限公司，江蘇 漣水 223411）

響應面法優化枯草芽孢桿菌S0507產四甲基吡嗪的培養條件

祝賽峰1，吳建峰2，趙希榮1,*

（1.淮陰工學院生命科學與化學工程學院，江蘇 淮安 223003；2.江蘇今世緣酒業有限公司，江蘇 漣水 223411）

通過 響應面分析法對枯草芽孢桿菌S0507產四甲基吡嗪（tetramethylpyrazine，TTMP）培養工藝進行優化。經單因素試驗后，以Box-Behnken法設計考察培養時間、培養溫度、水分含量3 個因素對TTMP產量的交互影響，用Design-Expert v8.0.1.6軟件對BBD試驗數據進行分析處理。通過響應面試驗得到的最佳培養條件為：低溫培養時間33.84 h、培養溫度41.75 ℃、水分含量59.63%，TTMP產量為332.70 mg/kg，理論值（335.49 mg/kg）與實驗值的相對偏差為0.84%，證明應用響應曲面法優化枯草芽孢桿菌S0507產TTMP的培養條件是可行的。

四甲基吡嗪；枯草芽孢桿菌；響應面法；氣相色譜分析

四甲基吡嗪（tetramethylpyrazine，TTMP），又稱川芎嗪，具有烘烤香氣、甜香，是中國白酒中的重要香氣化合物，因此，在中國傳統白酒中均檢測到一定量的四甲基吡嗪[1-4]。已證明其具有擴張血管、改善微循環及抑制血小板集聚等作用[5-7]。因而其不僅對中國白酒風味有重要的貢獻，而且還賦予了中國白酒有益健康的功能[8-9]，所以，對白酒中四甲基吡嗪的研究，已成為白酒有益于健康研究的重要方向。

目前，國內外TTMP的實驗室制備方法主要有從川芎中萃取TTMP的直接提取法[10]、利用非Strecker降解方法化學合成TTMP的化學合成法[11]以及微生物發酵法[12-13]。Kosuge等[14]在納豆中分離得到TTMP，發現枯草芽孢桿菌具有發酵產生TTMP的能力。Zak等[15]從發酵可可豆中找到了發酵產TTMP的枯草芽孢桿菌，且只有在枯草芽孢桿菌生長時，體系中才會有TTMP。Huang等[16]考察了乙偶姻/乙酸銨模型體系中TTMP的生成過程，并提出了弱酸高壓條件下TTMP的生成機制。莊名揚等[17]介紹了美拉德反應與醬香型白酒香味成份間的聯系，還闡述了美拉德反應不僅是酒體香和味的微量物質，同時也是其他香味物質的前驅物質[18]。吳建峰[1]提出在白酒制曲過程和釀酒堆積發酵過程均會發生美拉德反應，TTMP是美拉德反應的產物。徐巖等[2]對中國白酒中四甲基吡嗪的來源及產生機制進行了深入的研究，研究驗證了中國白酒中四甲基吡嗪產生的主要途徑來源于微生物的代謝反應，并非美拉德反應。

本實驗采用微生物發酵法生產TTMP，即對篩選得到的枯草芽孢桿菌S0507進行培養條件的優化，得到枯草芽孢桿菌S0507產TTMP的最佳培養條件。

1 材料與方法

1.1 菌種與培養基

枯草芽孢桿菌S0507，由江蘇省生物釀酒技術研究院篩選并保藏。

基礎種子培養基：牛肉膏0.3 g/100 mL、蛋白 胨1 g/100 mL、NaCl 0.5 g/100 mL，pH值調至7.2～7.4，于121 ℃高壓蒸汽濕熱滅菌20 min。

1.2 試劑與儀器

2,3,5,6-四甲基吡嗪（TTMP）、2-乙酰基吡啶（2-acetylpyridine） 美國Sigma公司（純度＞98%）；乙酸丁酯、95%乙醇（分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；麩皮、花生粉 江蘇今世緣酒業股份有限公司。

GC6890氣相色譜儀 安捷倫上海科技有限公司；雷磁PHS-3C精密pH計 上海精密科學儀器有限公司；TDL-60C低速臺式離心機 上海安亭科學儀器廠；SHZ-82氣浴恒溫振蕩箱 金壇市杰瑞爾電器有限公司；JB-CJ-1FCS無菌操作臺 南通市東盛實驗室裝備有限公司。

1.3 菌種培養

枯草芽孢桿菌培養基本條件（活化）：從斜面上挑取一環菌落至新鮮的瓊脂固態斜面上，于37 ℃恒溫培養。基礎種子培養液培養條件：從新鮮斜面上挑取一環菌落至種子培養液中（每100 mL三角瓶裝20 mL培養基），于37 ℃、120 r/min下搖床培養24 h。麩皮固態培養基培養條件：從基礎種子培養液中按2%接種于固態培養基，攪拌均勻后置于隔水式恒溫培養箱培養。

1.4 單因素培養條件試驗

采用兩階段培養模式，即前期低溫培養和后期高溫培養，實驗中固定高溫（60 ℃）與培養時間（24 h），研究低溫培養溫度（簡稱培養溫度）、低溫培養時間（簡稱培養時間）、原料比對TTMP產量的影響。固定原料比（麩皮與花生粉質量比）為7∶3、水分含量為50%、溫度為45 ℃，考察培養時間（24、30、36、42、48 h）對TTMP產量的影響；固定麩皮與花生粉質量比為7∶3、水分含量為50%、培養時間為48 h，考察培養溫度（29、33、37、41、45、49 ℃）對TTMP產量的影響；固定麩皮與花生粉質量比為7∶3、溫度為45 ℃、時間為48 h，考察水分含量（45%、50%、55%、60%、65%、70%）對TTMP產量的影響；固定培養時間為48 h、水分含量為50%、培養溫度為45 ℃，考察麩皮與花生粉質量比9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6，即固態培養基中花生粉不同含量（10%、20%、30%、40%、50%、60%）對TTMP產量的影響。同一水平實驗重復3 次。

1.5 響應曲面分析法

在單因素研究的基礎上，選取培養時間、培養溫度和水分含量3 個因素為自變量，以TTMP含量為響應值，根據Box-Behnken設計原理，設計響應曲面分析試驗。

1.6 TTMP的測定方法

1.6.1 TTMP的提取

稱取發酵后培養基5 g，搗碎，置于100 mL三角瓶中，加50 mL 12%乙醇溶解，浸泡10 min，超聲30 min，4 500 r/min離心10 min，吸取5 mL上清液于試管，并加入1.4 mL乙酸丁酯，混勻溶液，萃取TTMP。將萃取液置于4 ℃冰箱中靜置，以防止萃取相中溶劑的揮發。

1.6.2 氣相色譜法測定TTMP

樣品處理：將萃取液除去乳化層，用1 000 μL移液器吸取上清液于2 mL離心管，用乙酸丁酯定容至1.5 mL，再用10 μL進樣器加1 μL內標30 mg/mL 2-乙酰基吡啶，混勻[19-20]。

TTMP的定量分析：進樣量1 μL，進樣口溫度為50 ℃，N2流速為1.0 mL/min；氮磷檢測器溫度為250 ℃，N2為載氣，流速為2 mL/min，H2流速為3 mL/min，Air流速為60 mL/min。毛細管色譜柱為Agilent 19011F-102（25 m×0.2 mm，0.30 μm），恒壓模式。程序升溫：50 ℃以10 ℃/min速率升溫至100 ℃，恒溫5 min，以5 ℃/min速率升溫至150 ℃，恒溫10 min，再以10 ℃/min速率升溫至210 ℃，保持5 min。

TTMP的標準曲線：y＝0.032 2x－0.035 8。其中，y是TTMP與內標2-乙酰基吡啶的峰面積之比，x是TTMP的質量濃度/（μg/mL）。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 培養時間對產TTMP的影響

如圖1所示，培養時間為24～30 h時，TTMP產量平穩上升；培養時間為30～36 h時，TTMP產量上升趨勢較陡；培養時間為36～42 h時，TTMP產量下降趨勢較陡；培養時間42～48 h時，TTMP產量平穩下降。這表明，TTMP對培養時間很敏感。隨著培養時間的增加，培養基能提供充足的碳源、氮源，細胞處于生長期，代謝旺盛，中間產物不斷增加，為TTMP的積累提供前體，TTMP產量相應地提高，在培養時間36 h時，TTMP產量達到最大值。然而，當培養時間大于36 h時，由于高溫培養時間過短，低溫時生成中間產物未能完全轉化為TTMP，因而TTMP生成量開始下降。因此，培養時間應選擇36 h。

2.1.2 培養溫度對產TTMP的影響

現已證實，微生物生長、代謝產物的合成均與酶的催化作用有關，在微生物代謝產物的合成過程中，培養溫度對微生物的生長，關鍵酶酶活性具有重要影響[12]。如圖2所示，當培養溫度從29 ℃升高到41 ℃時，產物TTMP含量呈上升趨勢，當溫度高于41 ℃時，TTMP含量呈下降趨勢。在試驗設計范圍內，培養溫度41 ℃時TTMP產量達到最大值，比初始培養溫度（29 ℃）時的TTMP產量提高了7.68 倍。這表明產TTMP過程對培養溫度較為敏感。培養溫度過低，菌株生長緩慢，生長延滯期長；溫度過高，則導致微生物細胞內酶系失活，菌株生長和產物的合成受到抑制；適宜的培養溫度有利于菌體的生長，同時酶活力較高，利于中間產物的積累，TTMP的產量最高。因此，選擇培養溫度36 h進行響應面優化試驗。

2.1.3 水分含量對產TTMP的影響

如圖3所示，當水分含量低于60%時，產物TTMP產量呈上升趨勢；當水分含量為60%時， TTMP產量最高；當水分含量高于60%時，呈下降趨勢。這表明，產TTMP S0507枯草芽孢桿菌對水分含量十分敏感，隨著水分含量的增加，枯草芽孢桿菌發酵活動比較活躍，TTMP產量也相應地提高。當水分含量從45%上升至60%時，TTMP產量提高了1.64 倍。水分含量過高，培養基結塊，造成氧氣含量不夠，影響微生物生長代謝。因此，培養基水分含量選擇60%。

圖3 水分含量對產TTMP的影響Fig.3 Effect of solid-to-liquid ratio on the yield of TTMP

2.1.4 原料比對產TTMP的影響

圖4 花生粉含量對產TTMP的影響Fig.4 Effect of wheat bran-to-peanut meal on the yield of TTMP

如圖4所示，隨著原料比（麩皮與花生粉質量比）的下降，即花生粉含量的增大，產物TTMP含量增加。當原料比（麩皮與花生粉質量比）為5∶5，即花生粉含量為50%時，TTMP含量開始下降，且變化趨勢較平穩。這表明，枯草芽孢桿菌S0507產TTMP的過程對花生粉含量較敏感，隨著花生粉含量的增加，枯草芽孢桿菌的發酵活動較平穩，菌體生長代謝穩定，TTMP產量也相應地提高，但是提高幅度不大。當花生粉含量增加至50%時，TTMP產量僅提高了0.69 倍；當花生粉含量繼續增加時，麩皮含量較少，微生物代謝所需的碳源不夠，導致TTMP含量下降。因此，花生粉含量為30%～50%時，最利于TTMP的生成和積累，且變化趨勢較平穩。結合實際生產成本，麩皮2.0～5.0 元/kg，花生粉16.0～22.0 元/kg，綜合考慮，固定花生粉含量為30%，即麩皮、花生粉質量比為7∶3。

2.2 響應曲面試驗結果與分析

2.2.1 Box-Behnken設計試驗

以培養時間（X1）、培養溫度（X2）、水分含量（X3）為自變量，以TTMP產量為響應指標，采用Box-Behnken方法設計響應面分析試驗，試驗設計及結果如表1所示。

表1 響應面試驗設計及結果Table 1 Experimental design and results for response surface analysis

2.2.2 模型建立與方差分析

根據表1的試驗結果，利用Design Expert v8.0.1.6軟件對試驗數據進行分析，所得主要分析結果如表2所示。

表2 回歸與方差分析結果Tbale 2 Results of regression and variance analysis

二次模型中回歸系數的顯著性檢驗（表2）表明：因素X1、X2對產TTMP效果的線性效應極顯著，因素X3對產TTMP效果的線性效應不顯著；因素X12、X2

2、X3

2對產TTMP效果的曲面效應顯著，因素X1X2、X2X3、X1X3對產TTMP效果的交互影響不顯著。對試驗數據進行多次擬合回歸，以TTMP產量（Y）為因變量，培養時間（X1）、培養溫度（X2）、水分含量（X3）為自變量建立回歸方程模型為：Y ＝320.39－58.24X1＋42.92X2－11.55X3＋11.37X1X2－6.45X1X3－0.93X2X3－77.08X12－103.82X22－90.83X32。另外，由表2可知，試驗各因素對TTMP產量影響顯著程度由大到小依次為培養時間＞培養溫度＞水分含量；模型的回歸F值為28.021，P ＝ 0.000 9（P＜0.05），表明該模型極顯著；多元相關系數R2＝0.981，調整R2＝0.946，表明模型對試驗實際情況擬合較好，但由于失擬較顯著（失擬P ＝0.015 3），需對實驗結果進行驗證。

2.2.3 響應面圖及等高線圖分析

由響應曲面圖和等高線圖（圖5～7）可知，培養溫度與培養時間交互作用、水分含量與培養時間交互作用、水分含量與培養時間交互作用均不顯著，與表2中交互項P值的分析結果一致。

圖5 培養溫度與時間及其交互作用對TTMP產量影響的響應面和等高線圖Fig.5 Response surface and contour of effect showing the interactive effect of culture temperature and time on the yield of TTMP

由圖5可知，響應曲面的坡度較為陡峭，表明TTMP產量對培養時間和溫度的變化較為敏感。在培養時間不變的條件下，隨著培養溫度水平的逐漸提高，TTMP產量呈先上升后下降的變化趨勢；在培養溫度不變的條件下，隨著培養時間的逐漸增加，TTMP產量呈先上升后下降的趨勢，且變化較大。從等高線可看出培養時間變化對TTMP產量的影響比培養溫度變化對TTMP產量的影響更大。等高線呈圓形，表明兩因素之間的交互作用強度較弱，影響不顯著。

由圖6可知，響應曲面的坡度較為陡峭，表明TTMP產量對培養時間和水分含量的變化較為敏感。在水分含量不變的條件下，隨著培養時間的逐漸增加，TTMP產量先上升后下降；在培養時間不變的條件下，隨著水分含量的逐漸增大，TTMP產量先上升后下降。從等高線可看出培養時間變化對TTMP產量的影響比水分含量變化對TTMP產量的影響大。等高線呈圓形，表明兩因素之間的交互作用強度較弱，影響不顯著。

圖6 水分含量和培養時間對TTMP產量交互作用影響的響應面和等高線圖Fig.6 Response surface and contour showing the interactive effect of solid-to-liquid ratio and culture time on the yield of TTMP

圖7 水分含量和培養溫度對TTMP產量交互作用影響的響應面和等高線圖Fig.7 Response surface and contour showing the interactive effect of solid-to-liquid ratio and culture temperature on the yield of TTMP

由圖7可知，響應曲面的坡度較為陡峭，表明TTMP產量對培養溫度和水分含量的變化較為敏感。在水分含量不變的條件下，隨著培養溫度的逐漸提高，TTMP產量先上升后下降；在培養溫度不變的條件下，隨著水分含量的逐漸增大，TTMP產量先上升后下降。從等高線可看出培養溫度變化對TTMP產量的影響比水分含量變化對TTMP產量的影響大。等高線呈圓形，表明兩因素之間的交互作用強度較弱，影響不顯著。

通過Design Expert（v8.0.1.6）軟件分析，枯草芽孢桿菌S0507產TTMP的最佳培養條件為培養時間33.84 h、培養溫度41.75 ℃、水分含量59.63%，此條件下TTMP產量的理論值為335.49 mg/kg。

2.2.4 回歸模型的驗證實驗

為檢測所得結果的可靠性，對上述優化條件進行3 次平行實驗，即麩皮與花生粉質量比為7∶3、接種量為2%、培養時間為33.84 h、培養溫度41.75 ℃、水分含量59.63%，50 g的麩皮固態培養基，共培養時間共48 h，實際測得的平均TTMP產量為332.70 mg/kg，理論值與實驗值的相對偏差為0.84%，證明應用響應曲面法優化枯草芽孢桿菌S0507產TTMP的培養條件是可行的。

3 結 論

本實驗通過單因素試驗分析了培養條件對TTMP產量的影響，并結合Box-Behnken設計及響應面分析，建立了枯草芽孢桿菌S0507發酵條件的二次多項式模型，并經顯著性檢驗證明了該模型具有可靠性。所得二次回歸方程為：Y＝ 320.39－58.24X1＋42.92X2－11.55X3＋11.37X1X2－6.45X1X3－0.93X2X3－77.08X12－103.82X22－90.83X32。該方程回歸系數極顯著，調整R2較高，實際擬合度較好。對方程進行優化，得枯草芽孢桿菌S0507最佳發酵條件：低溫培養時間為33.84 h、培養溫度為41.75 ℃、水分含量為59.63%、麩皮與花生粉質量比為7∶3。在此條件下，TTMP實際產量為332.70 mg/kg，理論值（335.49 mg/kg）與實驗值的相對偏差為0.84%，表明應用響應曲面法優化枯草芽孢桿菌S0507產TTMP的培養條件是可行的。

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Response Surface Methodology for Optimization of Culture Conditions for the Production of Tetramethylpyrazine by Bacillus subtilis S0507

ZHU Sai-feng1, WU Jian-feng2, ZHAO Xi-rong1,*

(1. School of Chemical Engineering and Life Science, Huaiyin Institute of Technology, Huai’an 223003, China; 2. Jiangsu King’s Luck Brewery Joint-Stock Co. Ltd., Lianshui 223411, China)

Tetramethylpyrazine (TTMP) was prepared from Bacillus subtilis S0507 under solid-state fermentation. Response surface methodology (RSM) was applied to optimize the culture conditions. On the basis of the results of one-factor-at-atime experiments, a Box-Behnken design (BBD) was used to investigate the interactive effect of culture temperature, time and solid-to-liquid ratio (water content of the solid medium) on TTMP production, and the experimental data obtained were analyzed with Design-Expert v8.0.1.6 software. The optimal culture conditions as determined by response surface analysis were 33.84 h, 41.75 ℃ and water content of 59.63%. The measured yield of TTMP under the optimized conditions was 332.70 mg/kg, showing a relative deviation of 0.84% in comparison with the theoretically predicted value of 335.49 mg/kg. Thus, response surface methodology is feasible to optimize the culture conditions for TTMP production by Bacillus subtilis S0507.

tetramethylpyrazine; Bacillus subtilis; response surface methodology; gas chromatography (GC)

TS201.3

A

1002-6630（2014）09-0218-06

10.7506/spkx1002-6630-201409043

2013-06-25

祝賽峰（1990—），女，本科，研究方向為傳統白酒中有益組分的開發和利用。E-mail：1053127348@qq.com

*通信作者：趙希榮（1961—），男，教授，博士，研究方向為生物大分子的改性與利用。E-mail：zhaoxirong1961@163.com