北京棒桿菌天冬氨酸激酶G377定點突變及酶學性質表征

朱運明，王曉飛，閔偉紅，詹冬玲，王隆洋

北京棒桿菌天冬氨酸激酶G377定點突變及酶學性質表征

朱運明，王曉飛，閔偉紅*，詹冬玲，王隆洋

（小麥和玉米深加工國家工程實驗室，吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林 長春 130118）

采用飽和定點突變和高通量篩選技術，對北京棒桿菌天冬氨酸激酶（aspartate kinase，AK）AK Gly377位點進行突變，并篩選獲得高活力突變體G377F，分離純化后對G377F AK酶學性質進行表征。結果表明：突變體AK最適pH值為9.0，較突變前野生型（wide type，WT）最適pH值為8.5有所提高；最適反應溫度與WT一致，均為25 ℃；半衰期由WT的2.6 h提高到5.3 h；pH耐受性在5 h內保持其活力50%以上，與WT 3 h內酶活力保持能力相同。G377F對金屬離子和有機溶劑均表現出良好的抗性。其中，Lys的抑制作用在一定程度上被解除，當Lys和Met同時存在時對AK具有明顯的激活作用。動力學研究顯示：G377F AK Vmax較WT提高9.3 倍；n值為1.0明顯低于WT的2.7，說明AK正協同性降低，趨向于米氏酶。

北京棒桿菌；天冬氨酸激酶；定點突變；酶學性質

天冬氨酸激酶（aspartate kinase，AK）廣泛存在于植物、細菌和真菌中，是生物合成蘇氨酸、賴氨酸、異亮氨酸和蛋氨酸的關鍵酶之一[1-4]。植物中大部分含有3 種單功能酶AKS（AKⅠ、AKⅡ和AKⅢ）和2種雙功能酶AK-高絲氨酸脫氫酶（AKⅠ-HSDHⅠ和AKⅡ-HSDHⅡ）[5-7]。來自大腸桿菌中的AKⅠ和AKⅢ分別受蘇氨酸、賴氨酸和亮氨酸的反饋抑制[8]，而來自谷氨酸棒桿菌中的AK受賴氨酸和蘇氨酸協同抑制[9-10]。因此，為使代謝產物過量積累，提高AK催化活力，解除其代謝產物的抑制作用對氨基酸的合成至關重要。

谷氨酸棒桿菌中AK是α2β2四聚體結構[11-13]。α亞基包含兩個結構域，即N末端的催化結構域和C末端的調控結構域，且α亞基和β亞基的C末端區域功能相同，由兩個ACT區域組成（ACT1，ACT2），以βαββαβ折疊結構形式存在[14]。在每個αβ調節區中都含有兩個蘇氨酸分子和一個賴氨酸分子。其中，賴氨酸存在于由β亞基ACT1和α亞基ACT2構成的位點處，其羧基通過氫鍵與Ile44（β）-N、Val360（α）-N、Thr361（α）-N和Thr361（α）-O?1相連，并與Gly359-N和Ile42-O通過兩個水分子形成氫鍵，最終賴氨酸通過所形成的鍵橋水分子進一步穩定[15]。因此，Gly359位點具有穩定配體Lys與A K結合的作用，從而加強了Lys對AK的反饋抑制。我們推測，將該位點改變以期打破其與Lys間的非共價鍵作用，從而解除賴氨酸對天冬氨酸激酶的反饋抑制。

由于北京棒桿菌中AK晶體結構未報道，而該菌中AK與谷氨酸棒桿菌中AK序列同源性高達99%，因此，本實驗選擇谷氨酸棒桿菌中AK晶體結構（3aaw，PDB）[16]為模板對北京棒桿菌中AK進行研究。通過結構分析，谷氨酸棒桿菌Gly359和Lys601氨基酸位點（圖1）分別對應于北京棒桿菌中Gly377和Lys619。在北京棒桿菌AK基因與載體pET-28a實現重組的基礎上，運用基因工程技術對AK基因Gly377進行飽和定點突變，探討北京棒桿菌中AK基因序列Lys619與Gly377位點間的非共價鍵作用對AK活力的影響，為天冬氨酸族氨基酸基因工程菌的構建提供參考。

圖1 谷氨酸棒桿菌中Gly359與Lys601非共價鍵作用圖Fig.1 The non-covalent bond interaction between Gly359 and Lys601 in Corynebacterium glutamicum

1 材料與方法

1.1 菌種、試劑與培養基

大腸桿菌E. coli BL21（DE3）和北京棒桿菌 本實驗室保存。

質粒pET28a-AK 本實驗室構建[17]。丙烯酰胺、甲叉雙丙稀酰胺、Tris、過硫酸銨、硫酸卡那霉素和β-巰基乙醇 北京鼎國昌盛生物技術有限公司；PVDF膜 中國Bio-Rad公司；PCR試劑盒、定點突變試劑盒、DpnI消化酶和質粒提取試劑盒、PCR引物 生工生物工程（上海）股份有限公司；ATP 日本MYM生物技術有限公司；非變性鎳柱及柱料 美國GE公司；HRP Mouse Anti-6×His 美國BD PharmingenTM公司；DNA Marker 日本TaKaRa公司；DAB顯色試劑 中國Maixin_Bio公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）蛋白電泳試劑的配制參照文獻[18]。

大腸桿菌LB培養基，按照文獻[19]配制。

1.2 儀器與設備

UV1700紫外-可見分光光度儀 日本島津公司；Scientz-ⅡD超聲破碎儀 寧波新芝生物科技有限公司；Z36HK高速冷凍離心機 德國Hermle公司；SE260垂直電泳儀 美國Amersham Biosciences公司；Jin-x水平瓊脂糖凝膠電泳槽 大連競賣生物科技有限公司；Eppendorf AG PCR儀 德國Eppendorf公司；CL-32L高壓蒸汽滅菌器 日本ALP公司；InfinitieM200酶標儀瑞士Tecan公司；Trans-Blot SDCell蛋白印跡轉膜儀 美國Bio-Rad公司；TG-16W臺式微量高速離心機 長沙湘智離心機儀器有限公司；Sartorius BSA224S分析天平賽多利斯科學儀器（北京）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 飽和定點突變及引物設計

根據北京棒桿菌Corynebacterium pekinense中AK基因序列設計高通量突變引物，上游引物 5’-CTTCCATG AACTCTGCGGTAACNNNTGGGGTGAGACTG-3’；下游引物5’- GCATGCAGTCTCACCCCANNNGTTACCGC AGAG-3’。下劃線為突變位點。定點突變聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）以pET-28a-AK為模板，在上述引物作用下擴增。PCR反應體系：ddH2O 34 μL，10×LA PCR Buffer 5 μL，dNTP Mixture 8 μL，模板DNA 2 μL，引物各2 μL， LA Taq 0.5 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性4 min；94 ℃ 1 min、56 ℃退火1 min、72 ℃延伸10 min，循環18 次；72 ℃、20 min。PCR產物用DpnⅠ酶消化除去模板后直接轉入E.coli BL21感受態細胞中，將轉化成功單菌落接種至LB液體培養基中活化并送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，測序引物如下：上游引物5’-GGAATTCCATATGGCCCTGGTCGT ACAGAA-3’；下游引物5’-GGAATTCTTAGCGTCCGGT GCCTGCAT-3’。

1.3.2 AK基因驗證、誘導表達、酶液制備及純化

基因驗證PCR反應體系：ddH2O 36 ?L，10×PCR Buffer 5 ?L，dNTP 4 ?L，引物各1 ?L；模板3 ?L；Taq 0.25 ?L。該反應以突變成功的pET-28a-AK為模板，引物為上述測序引物。擴增程序：94 ℃預變性4 min；94 ℃、40 s，58 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，循環30 次；72 ℃、10 min。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳驗證。

經測序檢測AK Gly377發生突變的菌株再次活化，并將其種子菌液按照2%接種量轉移到500 mL（含250 mL培養基）搖瓶中，200 r/min、37 ℃培養，待菌體濃度OD600nm值0.6～0.8時，加異丙基硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-thiogalactopyranoside，IPTG）誘導劑（終濃度為1 mmol/L）誘導發酵8 h后，4 ℃、8 000 r/min離心10 min去上清液，收集菌體，pH 7.4磷酸鹽緩沖液（phosphat buffered saline，PBS）重懸，PBS體積與菌體質量為7∶1。充分混勻后，冰浴超聲波破碎后，4 ℃、8 000 r/min離心10 min得到上清液，過0.45 μm膜即為粗酶液。用非變性鎳柱對酶液進行純化。先后用20 mmol/L咪唑20 mL、40 mmol/L咪唑15 mL、70 mmol/L咪唑10 mL、100 mmol/L咪唑5 mL以及200 mmol/L咪唑3 mL洗脫除去雜質蛋白質，用500 mmol/L咪唑10 mL洗脫得到純化后AK蛋白。

1.3.3 AK酶活力測定

利用吸光光度法通過檢測天冬氨酸異羥肟酸A540nm值改變來測定天冬氨酸激酶酶活力[20-21]。200 μL反應體系中含800 mmol/L KCl、10 mmol/ L-Asp、94 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）、10.4 mmol/L ATP、16 mmol/L MgSO4、10 mmol/L β-巰基乙醇、800 mmol/L NH3·H2O、10 μL酶液，在28 ℃、120 r/min條件下反應30 min；試管5 mL反應體系組成同200 μL反應體系，100 μL酶液，在26 ℃水浴條件下反應30 min，均加入等體積FeCl3終止試劑。以不加底物的反應體系A540nm值作為對照，所測的A540nm即為天冬氨酸異羥肟酸離子的光學密度。反應速率V定義為單位時間（1 min）內單位質量（1 mg）酶的催化能力，單位表示為U/（mg·min）。酶活力U表示為1 000×A540nm值，純化后AK蛋白質質量濃度用考馬斯亮藍方法進行測定。

1.3.4 SDS-PAGE和Western blotting法檢測

純化后AK蛋白采用SDS-PAGE驗證；將含有目的蛋白AK的SDS-PAGE切下，15 V穩壓電轉1 h至PVDF膜上，2%～5%脫脂奶粉封閉，經HRP Mouse Anti-6×His（用TBS按1∶2 500稀釋）孵化2 h，DAB顯色7～10 min。

1.3.5 AK動力學研究

動力學分析方法是在其他試劑和條件不變的前提下，底物L-天冬氨酸濃度分別為0.5、1.0、3.0、5.0、7.0、9.0、10.0、12.0、14.0、16.0 mmol/L，測定AK活力，每個濃度均做3 個平行，利用Origin7.5軟件，以Hill方程進行非線性擬合。

1.3.6 最適反應溫度及最適pH值的研究

最適反應溫度：以天冬氨酸為底物，其他酶活力測定條件不變，測定不同反應溫度（15、20、25、28、 30、35、40、45、50 ℃）下AK活力，每組樣品檢測3 個平行。

最適反應pH值：溫度設為最適溫度，其他酶活力測定條件不變，測定不同pH值（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0）94 mmol/L Tris-HCl緩沖液下AK酶活力，每組樣品檢測3 個平行。

1.3.7 AK熱穩定性和pH值耐受性研究

將AK于最適反應溫度和最適pH值條件下保溫，每隔1 h測定其酶活力，將0 h條件下相對酶活力定義為100%，每組3 個平行。

1.3.8 金屬離子與有機溶劑對AK活力的研究

在酶反應體系考察不同濃度（0.2、1.0、5.0、10.0 mmol/L）的不同種類金屬離子（Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+、Cu2+、Fe3+、Ni2+）對AK酶活力的影響，以不添加金屬離子的相對酶活力定義為100%。考察甲醇、乙醇、丙三醇、異丙醇、乙腈、正丁醇、二甲基亞砜等有機溶劑對酶活力的影響，每種溶劑體積分數為1%、5%、10%、20%，以不添加有機溶劑的相對酶活力定義為100%，以上每組均做3 個平行。

1.3.9 底物抑制劑對AK活力的影響

考察不同濃度（0.2、1.0、5.0、10.0 mmol/L）抑制劑（L-methionine、L-lysine、L-threonine）對AK活力的影響，以未添加底物抑制劑的相對酶活力定義為100%，每組樣品3 個平行。

2 結果與分析

2.1 重組菌株的構建、SDS-PAGE及Western blotting檢測結果

圖2 AK基因PCR擴增1%瓊脂糖凝膠驗證結果Fig.2 1% Agarose electrophoresis of PCR amplification products of AK gene

突變后經篩選獲得12 株突變株，結合測序結果選擇AK酶活力較高有代表性菌株4 株，4 株突變株AK氨基酸序列中377 位點由野生型Gly分別突變成Asp、Phe、Tyr和Lys。將上述4 種突變體重組質粒分別轉化到大腸桿菌中，挑單菌落培養，提取質粒，對其雙酶切和核酸電泳檢測，結果如圖2所示，分子質量在1 000～2 000 bp存在目的單帶，這與AK基因分子質量為1 453 bp相符，表明突變體構建成功。

圖3 10% SDS-PAGE蛋白電泳圖和Western blotting檢測結果Fig.3 10% SDS-PAGE and Western blotting analysis

將非變性鎳柱處理得到的AK純化酶液經SDS-PAGE蛋白電泳和Western blotting驗證結果如圖3所示。野生型粗酶液、野生型純化液以及突變體純化液在分子質量為48 kD左右均存在目的帶，表明AK基因大量表達。由泳道2～6可看出，泳道2中目的條帶明顯比突變體目的帶粗，表明突變后AK基因的表達量較野生型低。

2.2 突變體的動力學分析

表1 WT和突變體動力學參數Table 1 Kinetic parameters of WT and mutant strains

注：n代表AK中亞基數，AK是四聚體結構，其n值在4以內。如果n=1，說明為米氏酶；如果n不等于1，說明為別構酶；當n＞1時，表明酶具有正協同性，n值越大正協同性越高；n＜1，為酶具有負協同性；如果n值接近1，表明趨于米氏酶。

如表1所示，G377D、G377F、G377Y、G377K的Vmax分別為9.8、33.9、25.2、27.4 U/（mg·min），較野生型（wide type，WT）菌株（3.3 U/（mg·min））分別提高了2.0、9.3、6.6、7.3 倍；n值均明顯低于WT，表明經突變后AK的正協同性降低。這可能是377 位點Gly由極性不帶電荷分別改變為Asp極性帶負電荷、Phe非極性（疏水）、Tyr極性帶正電荷和Lys極性不帶電荷，在一定程度上破壞了與抑制劑Lys間的非共價鍵作用，使亞基間聚合度降低，結構松散，導致抑制劑Lys結合位點由致密組織變得松散不穩定，不利于抑制劑的結合。突變體由別構酶趨向米氏酶，Vmax提高。本實驗針對酶活力提高最大突變株G377F進行酶學性質研究。

2.3 G377F酶學性質表征

2.3.1 最適溫度和最適pH值對AK活力的影響

圖4 不同pH值（a）和溫度（b）對G377F AK活力的影響Fig.4 Effects of pH (a) and temperature (b) on the activity of AK from G377F

由圖4a可知，G377F最適反應pH值為9.0，較WT pH 8.5有提高。當pH值在6～9變化時，隨pH值升高，G377F中AK活力呈增大趨勢；當pH值大于9.0時，AK活力急劇下降。由圖4b可知，G377F中AK最佳反應溫度為25 ℃，與WT相同，當溫度在15～25 ℃范圍內升高時，G377F AK活力呈現較大升高趨勢，當反應溫度高于25 ℃時，G377F AK活力呈顯著下降，溫度升高至50 ℃時，酶活力降低80%，與WT相比G377F AK耐高溫能力下降。

2.3.2 AK的熱穩定性和pH值耐受性研究

圖5 WT和G377F中AK的熱穩定性和pH值耐受性Fig.5 Stability and pH tolerance of AK from WT and G377F

由圖5可知，G377F中AK在最適反應溫度25 ℃條件下具有較好的穩定性，其半衰期為5.3 h，比WT半衰期2.6 h高，這可能是突變體酶亞基間的聚合度加強，因而熱穩定性加強。G377F中AK在最適pH 9.0條件下，其pH值耐受性在5 h內能保持其活力在50%以上，與WT 3 h內酶活力保持能力相同，10 h后兩者活力均下降80%左右。2.3.3 金屬離子對AK活力的影響

表2 金屬離子對WT和G377F中AK活力的影響Table 2 Effect of metal ions on the enzyme activity of AK from WT and G377F

表2為金屬離子對WT和G377Y中AK活力的影響。對G377F分析可知，Na+和Mg2+對酶活力基本無激活作用（除了Mg2+在0.2 mmol/L時有一定激活作用），而是表現出一定的抑制作用。K+在低濃度時對酶有激活作用，但隨著濃度的增加顯示出抑制作用。Ca2+在濃度0.2～10 mmol/L時對G377F都有激活作用，而對WT卻一直呈現抑制作用。當Mn2+、Cu2+和Fe3+濃度為0.2 mmol/L時，G377F相對酶活分別為192.88%、193.07%和186.99%，而隨著濃度增加表現抑制作用。Ni2+抑制作用更加明顯，當濃度為5 mmol/L時，G377F檢測不到酶活力。

2.3.4 有機溶劑對AK活力的影響

表3 有機溶劑對WT和G377F中AK活力的影響Table 3 Effect of organic solvents on the enzyme activity of AK from WT and G377F

由表3可知，所有有機溶劑對WT AK活力顯示明顯的抑制作用，而對G377F AK在低體積分數時均表現激活作用，隨著體積分數的增加都表現出抑制作用，說明G377F對有機溶劑表現出明顯的抗性。

2.3.5 底物抑制劑對AK活力的影響

表4為不同抑制劑組合對AK活力的影響，對比WT發現，低濃度（0.2 mmol/L）賴氨酸和蛋氨酸表現出對G377F激活作用，隨著濃度的升高，這種積極作用轉變為抑制作用。而賴氨酸＋蛋氨酸只有在高濃度（10 mmol/L）時，對AK呈現出抑制作用，其他濃度均為激活作用。除Thr＋Lys在1 mmol/L時有激活作用外，其他含有蘇氨酸的抑制劑均表現出對AK的抑制作用，說明突變后主要解除了賴氨酸對AK的部分抑制，這與本研究目的相符。

表4 底物抑制劑對WT和G377F中AK活力的影響Table 4 Effect of substrate inhibitors on the enzyme activity of AK from WT and G377F

3 結 論

本實驗對北京棒桿菌中AK基因Gly377位點進行飽和定點突變，以達到解除與抑制劑Lys間的非共價鍵作用并提高酶活力的目的。運用軟件Primer Premier5設計突變引物，以連接了北京棒桿菌中AK基因的重組質粒pET-28a-AK為模板進行突變，通過高通量成功篩選出G377F。并對G377F AK進行純化、10% SDS-PAGE和Western blotting驗證。結果表明：突變體G377F和WT AK分子質量均為48 kD，G377F AK Vmax較WT提高了9.3 倍，且正協同性降低。酶學性質研究表明，G377F AK最適pH值為9.0，最適反應溫度25 ℃；半衰期由WT的2.6 h提高到5.3 h；G377F pH值耐受性在5 h內保持其酶活力50%以上，與WT 3 h內酶活力保持能力相同。同時，G377F對金屬離子和有機溶劑均表現出良好的抗性，部分解除底物抑制劑Lys和Lys＋Met對AK酶活力的抑制作用。

[1] BLACK S, WRIGHT N G. Aspartic β-semialdehyde dehydrogenase and aspartic β-semialdehyde[J]. Journal of Biological Chemistry, 1955, 213(1): 39-50.

[2] MAS-DROUX C, CURIEN G, ROBERT-GENTHON M, et al. A novel organization of ACT domains in allosteric enzymes revealed by the crystal structure of Arabidopsis aspartate kinase[J]. Plant Cell, 2006, 18(7): 1681-1692.

[3] N?RDAL I, NETZER R, ELLINGSEN T E, et al. Analysis and manipulation of aspartate pathway genes for L-lysine overproduction from methanol by Bacillus methanolicus[J]. Applied andEnvironmental Microbiology, 2011, 77(17): 6020-6026.

[4] KUMAR D, GOMES J. Methionine production by fermentation[J]. Biotechnology Advances, 2005, 23(1): 41-61.

[5] PARIS S, VIEMON C, CURIEN G, et al. Mechanism of control of Arabidopsis thaliana aspartate kinase-homoserine dehydrogenase by threonine[J]. Journal of Biological Chemistry, 2003, 278(7): 5361-5366.

[6] CHEN Zhen, RAPPERT S, SUN Jibin, et al. Integrating molecular dynamics and co-evolutionary analysis for reliable target prediction and deregulation of the allosteric inhibition of aspartokinase for amino acid production[J]. Journal of Biotechnology, 2011, 154(4): 248-254.

[7] CURIEN G, RAVANEL S, ROBERT M, et al. Identification of six novel allosteric effectors of Arabidopsis thaliana aspartate kinasehomoserine dehydrogenase isoforms physiological context sets the specificity[J]. Journal of Biological Chemistry, 2005, 280: 41178-41183.

[8] SHIIO I, MIYAJIMA R. Concerted inhibition and its reversal by end products of aspartate kinase in Brevibacterium fl avum[J]. Journal of Biochemistry, 1969, 65(6): 849-859.

[9] DONG Xunyan, QUINNP J, WANG Xiaoyuan. Metabolic engineering of Escherichia coli and Corynebacterium glutamicum for the production of L-threonine[J]. Biotechnology Advances, 2011, 29(1): 11-23.

[10] KALINOWSHI J, BACHMANN B, THIERBACH G, et al. Aspartokinase genes LysCα and LysCβ overlap and are adjacent to the aspartate β-semialdehyde dehydrogenase gene asd Corynebacterium glutamicum[J]. Molecular and General Genetics, 1990, 224(3): 317-324.

[11] YOSHIDA A, TOMITA T, KONO H, et al. Crystal structures of the regulatory subunit of Thr-sensitive aspartate kinase from Thermus thermophilus[J]. FEBS Journal, 2009, 276(11): 3124-3136.

[12] DUMAS R, COBESSI D, ROBIN A Y, et al. The many faces of aspartate kinases[J]. Archives of Biochemistry and Biophysics, 2012, 519(2): 186-193.

[13] YOSHIDA T, TOMITA T, KURIHARA T, et al. Strutural insight into concerted inhibition of α2β2-type aspartate kinase from Corynebacterium glutamicum[J]. Molecular Biology, 2007, 368: 521-536.

[14] MARCO-MARIN C, RAMóN-MAIQUES S, TAV?REZ S, et al. Site-directed mutagenesis of Escherichia coli acetylglutamate kinase and aspartokinase iii probes the catalytic and substrate-binding mechanisms of these amino acid kinase family enzymes and allows three-dimensional modelling of aspartokinase[J]. Journal of Molecular Biology, 2003, 334(3): 459-476.

[15] YOSHIDA A, TOMITA T, KUZUYAMA T, et al. Mechanism of concerted inhibition of α2β2-type hetero-oligomeric aspartate kinase from Corynebacterium glutamicum[J]. Journal of Biological Chemistry, 2010, 285: 27477-27486.

[16] LIU Xuying, PAVLOVSKY A G, VIOLA R E. The structural basis for allosteric inhibition of a threonine-sensitive aspartokinase[J]. Journal of Biological Chemistry, 2008, 283(23): 16216-16225.

[17] 汪一名. 北京棒桿菌突變株 E31 天冬氨酸激酶基因的克隆與表達分析[D]. 吉林: 吉林農業大學, 2011.

[18] 汪家政, 范明. 蛋白質技術手冊[M]. 北京: 科學出版社, 2000.

[19] 金冬雁, 黎孟楓, 侯云德, 等. 分子克隆實驗指南[M].北京: 科學出版社. 2002.

[20] FOLLETTIE M T, PEOPLE O P, AGOROPOULOU C, et al. Gene structure and expression of the Corynebacterium fl avum N13 ask-asd operon[J]. Journal of Bacteriology, 1993, 175(13): 4096-4103.

[21] KATO C, KURIHARA T, KOBASHI N, et al. Conversion of feedback regulation in aspartate kinase by domain exchange[J]. Biochemical and Biophysical Researc h Communications, 2004, 316(3): 802-808.

Site-Directed Mutagenesis and Characterization of Aspartate Kinase G377 from Corynebacterium pekinense

ZHU Yun-ming, WANG Xiao-fei, MIN Wei-hong*, ZHAN Dong-ling, WANG Long-yang
(National Engineering Laboratory on Wheat and Corn Further Processing, College of Food Science and Engineering, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

Aspartate kinase (AK) is the first critical enzyme in the biosynthesis pathw ay of vital amino acids, in which AK is strictly regulated by metabolites. In the present study, AK from Corynebacterium pekinense was mutated using sitedirected mutagenesis combined with high-throughput screening and G377F with high activity was successfully constructed. Then, the purified AK from G377F was characterized. The results showed that the optimum reaction pH of G377F was 9.0, which was slightly higher than that of the wild-type strain (WT). The optimum reaction temperature of G377F was 25 ℃, which was consistent with that of WT. The half-life period of G377F increased from 2.6 h (WT) to 5.3 h. The pH tolerance of G377F maintained more tha n 50% of its original vitality in 5 h, which was identical to that of WT (3 h). In addition, AK from G377F had a good tolerance to metal ions and organic solvents. To some extent, the inhibition by Lys could be released and the co-presence of Lys and Met had an active effect on the G377F. Kinetic studies showed that the Vmaxof AK from G377F was 10.3 times higher than that of WT. The n value was 1.0, which was significantly lower than that of WT, indicating that the positive cooperativity of AK from G377F decreased, which showed that AK from G377F tended to be a Mich aelis enzyme.

Corynebacterium pekinense E31; aspartate kinase; site-directed mutagenesis; enzymatic activity

Q814.9

A

1002-6630（2014）09-0192-06

10.7506/spkx1002-6630-201409038

2013-10-29

吉林省自然科學基金項目（20130101139JC）

朱運明（1988—），男，碩士研究生，研究方向為發酵微生物的選育與代謝調控。E-mail：zhuming.1988.happy@163.com

*通信作者：閔偉紅（1971—），女，教授，博士，研究方向為發酵工程、糧食科學與深加工技術。E-mail：minwh2000@163.com