響應(yīng)面法優(yōu)化受精蛋蛋清制備抗氧化肽酶解工藝

王俊杰，趙 燕,*，涂勇剛，羅序英，李建科，陳彰毅

響應(yīng)面法優(yōu)化受精蛋蛋清制備抗氧化肽酶解工藝

王俊杰1，趙 燕1,*，涂勇剛2，羅序英1，李建科1，陳彰毅1

（1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生物質(zhì)轉(zhuǎn)化教育部工程研究中心，江西 南昌 330047；2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江西 南昌 330045）

以酶解產(chǎn)物的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2,2-diphenyl-1-（2,4,6-trinitrophenyl）hydrazyl，DPPH）自由基清除 率為指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇酶解溫度、pH值、底物質(zhì)量濃度、加酶量4 個(gè)因素，通過(guò)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析法優(yōu)化酶解受精蛋蛋清制備抗氧化肽的最佳工藝條件。結(jié)果表明：在酶解溫度46 ℃、pH 9.1、底物質(zhì)量濃度4.28 g/100 mL、加酶量21 000 U/g條件下，所得酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率活性最強(qiáng)，達(dá)到84.97%。堿性蛋白酶酶解得到的產(chǎn)物具有較強(qiáng)的抗氧化活性，優(yōu)化工藝條件與理論預(yù)測(cè)擬合度高。

受精蛋；抗氧化肽；酶解；響應(yīng)面

人體新陳代謝過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生一些活性氧和其他自由基產(chǎn)物，這些物質(zhì)的過(guò)量積累會(huì)對(duì)DNA、蛋白質(zhì)、膜脂質(zhì)和碳水化合物等生物大分子產(chǎn)生氧化性損傷[1-3]。據(jù)報(bào)道，這些物質(zhì)在一些疾?。ò┌Y、冠心病、糖尿病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、老年癡呆）的發(fā)生過(guò)程中起著重要作用[4-7]。在食品加工中脂肪氧化導(dǎo)致食品變質(zhì)，同時(shí)可能生成一些具有 潛在毒性的反應(yīng)產(chǎn)物[8]。雖然市場(chǎng)上有一些合成抗氧化劑如叔丁基對(duì)羥基茴香醚、二叔丁基對(duì)甲酚、叔丁基對(duì)二苯酚等，由于這些物質(zhì)不規(guī)范使用或?yàn)E用都具有很大的安全隱患[9]，因此在日常的使用中都有嚴(yán)格的控制，所以目前迫切需要開發(fā)具有天然安全、無(wú)毒副作用的抗氧化劑。

從動(dòng)植物蛋白分離制備生物活性肽是研究熱點(diǎn)，生物活性肽一般由3～20 個(gè)氨基酸殘基組成，并且其活性與氨基酸種類和序列有關(guān)[10]，這些生物活性肽自身具有營(yíng)養(yǎng)功能，且具有分子質(zhì)量小、熱穩(wěn)定、易吸收的特點(diǎn)。禽蛋含有豐富的蛋白質(zhì)，易吸收，并且其氨基酸組成與人體需要的必需氨基酸比例類似[11]。目前國(guó)內(nèi)外均是采用酶解的方式從禽蛋蛋白中分離制備抗氧化活性肽，如Tanzadehpanah等[12]用胃蛋白酶酶解鴕鳥蛋蛋清獲得LTEQESGVPVMK，Chen Chen等[13]用采用木瓜蛋白酶酶酶解雞蛋蛋清，獲得兩個(gè)抗氧化肽YLGAK（551.54 D）和GGLEPINFQ （974.55 D），Davalos等[14]用胃蛋白酶酶解蛋清獲得4 個(gè)抗氧化肽YAEERYPIL、SALAM、YQIGL、YRGGLEPINF。受精蛋是一種在特定的條件下能夠孵化的禽蛋，孵化過(guò)程中蛋內(nèi)的水分、蛋白質(zhì)、脂肪、無(wú)機(jī)鹽等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在酶的作用下進(jìn)行一系列的代謝和轉(zhuǎn)化[15]，這些物質(zhì)的變化為制備新型抗氧化肽提供基礎(chǔ)，此外本課題組前期測(cè)定了經(jīng)孵化后的受精蛋蛋清的抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)經(jīng)孵化后的受精蛋蛋清抗氧化活性有明顯提高[16]。本實(shí)驗(yàn)研究酶解受精蛋蛋清制備抗氧化肽的工藝條件，為下一步制備抗氧化肽提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

三黃雞受精蛋 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2,2-diphenyl1-（2,4,6-trinitrophenyl）hydrazyl，DPPH） 美國(guó)Sigma公司；硫酸亞鐵、鄰菲羅啉、鄰二氮菲、乙醇 國(guó)藥集團(tuán)（上海）化學(xué)試劑有限公司；堿性蛋白酶（10萬(wàn) U/g）上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司。

752N紫外-可見分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；AR1140電子天平 奧豪斯儀器（上海）有限公司；TDL-5-A離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；DKB-501A超級(jí)恒溫水槽 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；科裕KFU微電腦全自動(dòng)孵化機(jī) 山東省德州 市科裕孵化設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 受精蛋的孵化條件

孵化溫度38.2 ℃，相對(duì)濕度為60%。

1.2.2 樣品的制備

取孵化6 d的受精蛋蛋清→高速勻漿后冷凍干燥→堿性蛋白酶酶解→滅酶（95 ℃、10 min）→5 000 r/min 離心15 min→收集上清液即為抗氧化肽。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

以酶解液的DPPH自由基清除能力為指標(biāo)，分別 考察底物質(zhì)量濃度、加酶量、pH值、酶解溫度和酶解時(shí)間對(duì)酶解受精蛋蛋清制備抗氧化肽工藝的影響。

1.2.3.1 底物質(zhì)量濃度對(duì)酶解工藝的影響

分別按照底物質(zhì)量濃度為1、2、3、4、5、6 g/100 mL配制一定體積的溶液，加酶量為16 000 U/g，調(diào)pH 8.0，均在50 ℃水浴下酶解3 h，測(cè)定酶解液DPPH自由基清除能力，每個(gè)樣品測(cè)3 次平行。

1.2.3.2 加酶量對(duì)酶解工藝的影響

根據(jù)1.2.3.1節(jié)確定的最佳底物質(zhì)量濃度配制一定體積的溶液，加酶量分別為8 000、12 000、16 000、20 000、24 000、28 000 U/g, 調(diào)pH 8.0，均在50 ℃水浴下酶解3 h，測(cè)定酶解液DPPH自由基清除能力，每個(gè)樣品測(cè)3 次平行。

1.2.3.3 pH值對(duì)酶解工藝的影響

按照已確定的最佳底物質(zhì)量濃度和加酶量配制一定體積的溶液，分別調(diào)溶液pH值至7、8、9、10、11、12，均在50 ℃水浴下酶解3 h，測(cè)定酶解液DPPH自由基清除能力，每個(gè)樣品測(cè)3 次平行。

1.2.3.4 酶解溫度對(duì)酶解工藝的影響

按照已確定的最佳底物質(zhì)量濃度、加酶量和pH值配制一定體積的溶液，分別在40、45、50、55、60、65 ℃水浴下酶解3 h，測(cè)定酶解液DPPH自由基清除能力，每個(gè)樣品測(cè)3 次平行。

1.2.3.5 酶解時(shí)間對(duì)酶解工藝的影響

按照已確定的最佳底物質(zhì)量濃度、加酶量、pH值配制一定體積的溶液，在1.2.3.4節(jié)確定的最佳酶解溫度下，分別酶解0.5、1、2、3、4、5 h，測(cè)定酶解液DPPH自由基清除能力，每個(gè)樣品測(cè)3 次平行。

1.2.4 酶解工藝優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，在最佳的酶解時(shí)間4 h下，選取酶解溫度、pH值、底物質(zhì)量濃度、加酶量為自變量，酶解液的DPPH自由基清除率為響應(yīng)值，采用Box-Behnken原理，進(jìn)行四因素三水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

1.2.5 DPPH自由基清除能力測(cè)定

[17]方法，取4 mL新鮮配制的0.15 mmol/L的DPPH乙醇溶液于試管中，加1 mL水解液，振蕩混合均勻，暗處反應(yīng)20 min，于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，用相同體積的蒸餾水代替樣品做空白對(duì)照，每個(gè)濃度測(cè)3次平行。

式中：A2為4 mL DPPH＋1 mL樣品溶液的吸光度；A1為4 mL乙醇＋1 mL樣品溶液的吸光度；A0為4 mL乙醇＋1 mL水的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解制備抗氧化肽單因素試驗(yàn)

2.1.1 底物質(zhì)量濃度對(duì)受精蛋蛋清抗氧化肽清除DPPH自由基的影響

底物質(zhì)量濃度對(duì)酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除能力的影響如圖1所示，在一定的范圍內(nèi)，隨著底物質(zhì)量濃度的增大，酶解物的DPPH自由基清除能力逐漸增強(qiáng)，再增大底物質(zhì)量濃度，酶解產(chǎn)物清除率不增反降。這可能是由于底物質(zhì)量濃度的增加，酶與底物之間的接觸面積增大，使酶解效率增高，但當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度過(guò)高時(shí)，導(dǎo)致溶液的黏度增高，影響了酶與底物的作用，使酶解效率降低。

圖1 不同底物質(zhì)量濃度的酶解產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基清除率的影響Fig.1 Effect of substrate concentration on DPPH radical scavenging activity of hydrolysates

2.1.2 加酶量對(duì)受精蛋蛋清抗氧化肽清除DPPH自由基的影響

圖2 不同加酶量的酶解產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基清除率的影響Fig.2 Effect of enzyme amount on DPPH radical scavenging activity of hydrolysates

加酶量對(duì)酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除能力的影響結(jié)果如圖2所示，當(dāng)加酶量從8 000～12 000 U/g，酶解液的DPPH自由基清除率迅速升高，當(dāng)加酶量達(dá)到20 000、24 000 U/g時(shí)，酶解液的DPPH自由基清除率達(dá)到最高。這可能是因?yàn)樵诘孜锍渥愕那闆r下，隨著加酶量的增加，酶解反應(yīng)增強(qiáng)，當(dāng)酶量達(dá)到飽和后，一些活性肽可能會(huì)隨著酶解反應(yīng)的進(jìn)行再次被酶解，使其清除率下降。從經(jīng)濟(jì)角度考慮，選擇加酶量為20 000 U/g。

2.1.3 酶解pH值對(duì)受精蛋蛋清抗氧化肽清除DPPH自由基的影響

pH值對(duì)酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除能力的影響結(jié)果如圖3所示，當(dāng)pH值為9時(shí)，酶解產(chǎn)物的抗氧化活性最高，隨著pH值的升高，酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率呈下降趨勢(shì)，這可能是由于在強(qiáng)堿條件下，抑制了酶活力，導(dǎo)致酶解效率下降。所以，選擇pH 9最佳。

圖3 不同酶解pH值的酶解產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基清除率的影響Fig.3 Effect of pH on DPPH radical scavenging activity of hydrolysates

2.1.4 酶解溫度對(duì)受精蛋蛋清抗氧化肽清除DPPH自由基的影響

圖4 不同酶解溫度的酶解產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基清除率的影響Fig.4 Effect of hydrolysis temperature on DPPH radical scavenging activity of hydrolysates

酶解溫度對(duì)酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除能力的影響結(jié)果如圖4所示，40～45 ℃隨著溫度升高，DPPH自由基清除率隨著升高，并在45 ℃達(dá)到最大值。當(dāng)酶解溫度高于45 ℃后，酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率逐漸下降，這可能是由于當(dāng)酶解溫度小于酶的最適溫度時(shí)，隨著溫度升高可以提高酶的活性，且有利于底物折疊結(jié)構(gòu)的展開[18]；當(dāng)溫度繼續(xù)升高，超過(guò)了酶的最適宜溫度后，酶的活性受到抑制，甚至酶失活，使酶解效率降低。因而，選擇45 ℃為最佳酶解溫度。

2.1.5 酶解時(shí)間對(duì)受精蛋蛋清抗氧化肽清除DPPH自由基的影響

圖5 不同酶解時(shí)間的酶解產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基清除率的影響Fig.5 Effect of hydro lysis time on DPPH radical scavenging activity of hydrolysates

酶解時(shí)間對(duì)酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除能力的影響如圖5所示，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，酶解產(chǎn)物的DPPH自由基的清除能力呈增強(qiáng)的趨勢(shì)，酶解4 h，酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除能力最強(qiáng)。這可能是因?yàn)樵诿附夥磻?yīng)的初始階段，酶與底物的濃度較大，酶與底物的充分接觸使酶解反應(yīng)迅速，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，底物逐漸被消耗，酶的特異性催化位點(diǎn)減少[19]，使反應(yīng)減慢，繼續(xù)延長(zhǎng)酶解時(shí)間，使底物被過(guò)度酶解，導(dǎo)致酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除能力下降。

2.2 酶解制備抗氧化肽響應(yīng)面優(yōu)化工藝

2.2.1 響應(yīng)面優(yōu)化工藝結(jié)果

表1 制備抗氧化肽響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 1 Experimental design and results of response surface methodology for the preparation of antioxidant peptide

采用Design-Export 8.0.6進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化酶解工藝設(shè)計(jì)，獲得抗氧化肽制備的四因素三水平試驗(yàn)結(jié)果如表1所示。對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，回歸模型系數(shù)及顯著性見表2，得到回歸回歸方程為Y＝86.69＋3.07A＋1.13B＋2.59C＋1.89D－0.30AB－0.90AC＋0.30AD＋1.60BC－2.11BD－0.55CD－6.84A2－2.45B2－4.02C2－1.58D2。其中模型一次項(xiàng)A、C、D極顯著，B顯著；模型交互項(xiàng)BD顯著，模型二次項(xiàng)A2、B2、C2極顯著，D2顯著。說(shuō)明試驗(yàn)因素對(duì)DPPH自由基清除率的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。各因素對(duì)受精蛋蛋清酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率大小的影響依次為A＞C＞D＞B。

從表2回歸模型方差分析可知，模型（P＜0.000 1）極顯著，失擬項(xiàng)（P＝0.637 3）不顯著，表明模型與實(shí)際擬合程度較好，其中 R2＝0.933 3，說(shuō)明預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值之間具有較高的相關(guān)性；，說(shuō)明該模型能解釋86.66%的響應(yīng)值的變化，所以用該模型能夠較好的優(yōu)化酶解工藝。

表2 回歸模型的方差分析Table 2 Variance analysis for the established regression model

2.2.2 響應(yīng)面分析及因素間交互作用

模型的響應(yīng)曲面圖和等高線如圖6所示，由等高線的線型可直觀反映出因素間的交互影響，圓形表示兩因素交互影響不顯著，橢圓形表示因素間交互影響顯著[20]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AD、BC、BD的交互作用對(duì)酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率有顯著影響。圖6a表明底物質(zhì)量濃度4 g/100 mL、pH 9.0條件下，加酶量與溫度之間交互作用顯著，當(dāng)酶解溫度在40～50 ℃，酶解產(chǎn)物的DPPH自由基的清除率隨著加酶量的增加先增強(qiáng)后減弱，當(dāng)加酶量較高時(shí)，DPPH自由基的清除率變化不明顯。當(dāng)加酶量在18 000～22 000 U/g，酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率隨溫度的升高先增強(qiáng)后減弱。當(dāng)加酶量處于較高水平，溫度處于中間水平時(shí)，酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率較高。當(dāng)加酶量一定時(shí)，溫度增高，DPPH自由基清除率降低，這可能是由于溫度過(guò)高，破壞了酶的結(jié)構(gòu)，使活性降低，導(dǎo)致DPPH自由基清除率降低。圖6b表明，當(dāng)加酶量20 000 U/g，酶解溫度45 ℃時(shí)，底物質(zhì)量濃度與pH值之間交互作用對(duì)酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率有顯著影響。當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度一定時(shí)，酶解物的DPPH自由基清除率隨著pH值的升高呈先增強(qiáng)后減弱的趨勢(shì)，當(dāng)pH值一定時(shí)，酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率隨著底物質(zhì)量濃度的升高呈先增強(qiáng)后減弱的趨勢(shì)。當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度和pH值均處于中間水平時(shí)，酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率達(dá)到最高。圖6c表明，在底物質(zhì)量濃度4 g/100 mL、45 ℃條件下，加酶量和pH值之間交互影響顯著。當(dāng)pH值處于較低水平時(shí)，酶解物的DPPH自由基清除率隨加酶量的增加而增強(qiáng)，但當(dāng)pH值處于較高水平時(shí)，酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率隨加酶量的增加先增強(qiáng)后減弱。當(dāng)加酶量一定時(shí)，酶解產(chǎn)物的DPPH清除率隨pH值的升高先增強(qiáng)后減弱。

圖6 加酶量、溫度、pH值、底物質(zhì)量濃度交互影響DPPH自由基清除率的響應(yīng)曲面和等高線圖Fig.6 Response surface and contour plots for the interactive effects of enzyme amount, hydrolysis temperature, pH and substrate concentration on DPPH radical scavenging activity of hydrolysates

2.2.3 模型驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

由Design-Export 8.0.6對(duì)模型分析，得到模型自變量最佳值為酶解溫度46.07 ℃、pH 9.09、底物質(zhì)量濃度4.28 g/100 mL、加酶量21 015.51 U/g，在此優(yōu)化條件下酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率達(dá)到87.92%。根據(jù)實(shí)際條件最終選擇酶解溫度46 ℃、pH 9.1、底物質(zhì)量濃度4.28 g/100 mL、加酶量21 000 U/g，實(shí)際測(cè)得的酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率達(dá)到84.97%。理論值87.92%與實(shí)際值相對(duì)偏差為3.47%，說(shuō)明模型擬合得到的優(yōu)化結(jié)果較為準(zhǔn)確。

3 結(jié) 論

采用堿性蛋白酶酶解受精蛋蛋清，以酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率為指標(biāo)，采用Design-Export 8.0.6優(yōu)化得到酶解受精蛋蛋清制備抗氧化肽的最佳工藝條件，酶解溫度46 ℃、pH 9.1、底物質(zhì)量濃度4.28 g/100 mL、加酶量21 000 U/g。酶解4 h后得到的樣品對(duì)DPPH自由基的清除率達(dá)到84.97%。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該模型較為可靠，具有較好的預(yù)測(cè)能力。

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Optimization of Enzymatic Preparation of Antioxidant Peptides from Fertilized Egg White by Response Surface Methodology

WANG Jun-jie1, ZHAO Yan1,*, TU Yong-gang2, LUO Xu-ying1, LI Jian-ke1, CHEN Zhang-yi1
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Engineering Research Center of Biomass Conversion, Ministry of Education, Nanchang University, Nanchang 330047, China; 2. College of Food Science and Engineering, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China)

This paper reports on the optimization of preparation conditions for antioxidant peptides by hydrolyzing fertilized egg white with alkaline protease. One-factor-at-a-time method was used to explore the effect of hydrolysis temperature, pH, substrate concentration and enz yme amount on the 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging activity of hydrolysates. Subsequently, the response surface analysis based on Box-Behnken design was employed to optimize the hydrolysis conditions. The results showed that hydrolysates showing the highest DPPH scavenging rate of 84.97% were produced from hydrolysis of fertilized egg white at a substrate concentration of 4.28 g/100 mL at 46 ℃ and pH 9.1 with an enzyme amount of 21 000 U/g. In conclusion, peptides with high antioxidant activity can b e prepared by hydrolyzing fertilized eggs with alkaline protease and the optimized conditions al low accurate theoretical prediction.

fertilized egg; antioxidant peptide; enzymatic hydrolysis; response surface methodology

TS253.1

A

1002-6630（2014）09-0187-05

10.7506/spkx1002-6630-201409037

2013-06-26

南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自由探索課題（SKLF-TS-201112）；江西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（20132BAB214008）

王俊杰（1987—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：hnwjj87@163.com

*通信作者：趙燕（1980—），女，副研究員，博士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工與生物質(zhì)轉(zhuǎn)化。E-mail：zhaoyan@ncu.edu.cn